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薄层色谱法操作技术控制要点分析

 
 
薄层色谱仪 (Thin-layer Chromatography, TLC) 法作为色谱法的一个分支, 因其独具的设备简单、操作简便快捷、结果直观、兼具分离鉴定双重功能等长处而被广泛应用于药物分析特别是中药分析中。2010年版《中国药典》一部有3 341项鉴别采用TLC法。该法已成为分析实验室特别是中药检验人员的常规分析手段, 掌握其技术要点对于确保检验结果的准确可靠、提高工作效率和质量具有极其重要的意义。
 
长期以来, 由于薄层色谱方法学描述并不详细, 给操作者留有太多的空间, 造成其分析结果有时不能令人满意。因此, 有人认为薄层色谱是一种陈旧过时的技术, 应该用更可靠的高效液相色谱或其它色谱技术来代替它。其实这是一种误解:薄层色谱法的省时、低成本、检测手段多、信息来源多的优点是其它色谱技术不可比拟的。结果不满意往往是因为操作技术不规范或没有考虑到一些重要的影响因素造成的。笔者从工作实践中总结出薄层色谱操作中应该注意的问题及影响薄层色谱质量的因素, 现分述如下。
1 TLC操作方法及其注意事项
 
TLC操作方法包括薄层板的选用、点样、展开、显色、检视与记录五个步骤。
 
薄层色谱结果的好坏, 可以由色谱图中斑点分离度、清晰度和重现性来判定。由于薄层色谱是一种“敞开系统”的色谱技术, 除器材外, 外界环境条件对被分离物质的层析行为影响大, 操作技巧也明显影响色谱质量, 因而薄层色谱又被视为是一种较难驾驭的技术。
1.1 薄层板的选用
 
目前实验室已普遍采用市售高效薄层板, 以硅胶G型板最为常见, 相对于自制薄层板来说分离效果更好。由于硅胶表面的p H值约为5, 比较适合于酸性和中性物质的分离, 如有机酸、酚类、醛类等。碱性物质能与硅胶作用, 展开时易被吸附于原点不动或出现斑点脱尾现象。在自制薄层板时可用稀碱溶液制备薄层使其变为碱性, 或用碱性展开剂展开, 从而得到理想的图谱。
 
对薄层板的质量要求是厚度均匀一致、表面平整光滑、无麻点气泡、无破损污染。自制薄层板时, 要控制好铺板用的匀浆稠度, 过稠则板面容易出现层纹, 过稀则干后表面粗糙;使用前一般应于110℃下活化30 min, 活化后置干燥器中备用[1]。市售板在阴凉干燥处保存, 可直接使用。
 
不同生产厂家或不同批次的市售板质量往往不完全一致, 常会影响分析结果的重现性, 在重复性实验时尤应注意。
1.2 点样
1.2.1 点样方式
 
分为手动点样和自动点样。手动点样主要器具为微量毛细管、微量注射器等。自动点样采用半自动点样仪或全自动点样仪, 按预设程序自动点样。手动点样灵活方便, 常用于各种TLC鉴别中, 器具以微量毛细管最常用。仪器的自动点样准确性好, 常用于薄层扫描法的含量测定。
1.2.2点样方法
 
分为接触式点样和喷雾点样。喷雾点样为仪器控制, 在此不展开描述。接触式手工点样时, 应注意小心用点样器垂直接触薄层板表面以防止损伤板面。若薄层吸附剂表面被损坏或点成洼孔, 则展开后斑点成不规则形状:靠近溶剂前沿的化合物形成三角形, 靠近原点的化合物形成新月形, 影响测定结果。原点损失带来误差, 也将使展开后的定量和判断不准确。
1.2.3 点样应注意的问题
 
(1) 点样量:原点位置对样品容积的负荷量有限, 体积不宜太大, 一般为0.5~10μl, 样品的浓度通常为0.5~2 mg, 太浓时展开剂从原点外围绕行而不是通过整个原点把它带动向前, 使斑点脱尾或重叠, 降低分离效率。点样量太小, 不能检出清晰的斑点影响判断。点样量太多, 展开剂不能全部负载, 容易产生脱尾现象。
 
当点样量适合时, 可采用点状点样;当点样量过大, 原点无法负荷时, 可采用条带状点样, 得到更好的分离效果, 提高分辨率。
 
(2) 样品的溶剂:样品在溶剂中溶解度很大, 原点将变成空心圆, 影响随后的线性展开, 所以原则上应选择对被测成分可以溶解但溶解度不是很大的溶剂。
 
供试液的溶剂在原点残留会改变展开的选择性, 亲水性溶剂残留在原点吸收大气中的水分 (特别在高湿度环境) 对色谱质量也会产生影响, 因此除去原点残存溶剂是必要的, 但对遇热不稳定和易挥发的成分, 应避免高温加热, 以免成分被破坏或损失。
 
(3) 点样手法:接触式点样直径通?刂圃3 mm以内, 采用边点样边用吹风机吹干溶剂的方式。在同一原点进行多次点样时, 要尽可能使每次的点样环中心重合、直径大小一致, 以免形成多个环状, 在原点的不均匀分布将使展开后的色谱图带不够清晰和整齐[2]。
1.3 展开
 
展开是薄层色谱中最复杂的过程, 展开应注意以下几个问题。
1.3.1 展开剂的配制
 
配制展开剂时, 应严格控制其比例准确度, 如遇到比例很小的溶剂时, 应尽量满足其精确度要求, 而不是为图方便省事直接用滴管加入。展开剂配好后如果浑浊不清, 不能立即使用。应转移入分液漏斗中, 待其静置分层澄清后再取其上层 (或下层) 液进行展开。
1.3.2 展开剂的用量
 
展开剂的用量以薄层板放入的深度为距原点5 mm为宜, 切勿倒入过多, 将原点浸入展开剂, 成分将被展开剂溶解而不随展开剂在板上分离。
1.3.3 溶剂蒸气的作用
 
溶剂蒸气在薄层色谱中起着重要作用, 它和液相 (展开剂) 、固定相 (吸附剂) 一起构成了一个作用机制复杂的三维层析过程。
 
实际工作中有时会遇到这两种情况:第一种情况是边缘效应, 原因是混合溶剂在薄层板上爬行时, 沸点较低和与吸附剂亲和力弱的溶剂, 在薄层板两个边缘较易挥发, 因此在边缘的浓度比在中部的浓度小。往往产生边缘斑点走得快, 形成一个弧。第二种情况是两个溶剂前沿, 原因是两种极性相差很大的溶剂组成展开剂时, 吸附剂对不同极性溶剂产生吸附作用不同。
 
这两种情况的克服办法, 可将点好样的薄层板在展开剂的蒸气中预饱和15~30 min, 再进行展开。
1.3.4 溶剂的质量
 
展开剂中溶剂的质量直接影响薄层色谱分离能力。如果含有杂质超标、水分超标以及吸收空气中干扰气体等, 均可影响分离结果。如甲酸乙酯遇水容易水解, 如用多次开瓶的残存溶剂, 因逐渐吸收大气中的水分而不同程度地分解, 所得的色谱与用新鲜溶剂所得色谱有明显差别。
 
展开剂展开后, 溶剂比例发生变化, 勿重复使用。
1.4 显色
 
展开后的薄层, 可直接检视或显色后检视。显色方式有喷雾显色、浸渍显色和蒸气显色。
 
喷雾显色是将显色剂用喷雾的方法均匀撒于薄层板上, 操作时要尽可能控制液滴细微, 同时使板各部位的喷雾密度尽可能一致。显色剂的量要适当, 太多则烘干时间延长, 使斑点显色时间延长, 多余显色剂流向板下方, 容易产生斑点变形;太少则斑点反应不完全。
 
浸渍显色是将显色剂倒入容器内, 将整个板放入其中显色。浸渍显色对于定量分析来说, 可得到更加均匀的背景。浸渍显色要注意动作的细致和快速, 防止显色溶液溶解样品所造成的样品损失、色谱斑点变形及板面的破损。
 
显色后的薄层板如需进行扫描, 为使其隔绝空气, 避免水分或氧气等进一步参与反应, 可在板上覆盖一个大小相等的洁净玻璃板, 周围用胶布密封。
1.5 检视与记录
 
薄层图谱应及时进行检视和记录, 以避免图谱因环境因素发生变化。尽可能用摄像设备拍摄, 以光学照片或电子图像的形式保存。紫外光下拍摄图谱时, 应使用滤光片滤除紫外光以免图谱与肉眼观察间存在色差, 确保记录的真实完整。
2 影响薄层色谱分析的其它因素
2.1 样品的预处理及供试液的制备
 
当供试液中既有欲测成分而其它杂质成分存在较多时, 常由于相互干扰或背景污染难以得到满意的分离效果, 影响结果的判断。因此样品的预处理是一个非常关键的步骤?衫么獬煞趾驮又食煞值男灾, 增加液液萃取、固液萃取、吸附净化等步骤, 减少杂质干扰, 得到更加干净清晰的图谱。
2.2 吸附剂活性与相对湿度
 
在其它条件相同的情况下, 相对湿度对色谱质量的影响是很明显的。有些样品在低湿度的情况下分离好, 有些则需要在高湿度的情况下。当然, 大多数成分对相对湿度有较宽的适应性。相对湿度的控制方法, 可在双槽展开缸中一侧加入适当浓度的硫酸, 将点样后的薄层板放入另一侧槽中, 密闭放置15~30 min, 再加入展开剂展开。
2.3 温度
 
在相对湿度恒定的条件下, 一般在较高温度下展开时, Rf值较高, 反之降低。在展开温度相差较大时, 对色谱质量有不同程度的影响。这是因为温度的变化, 使展开剂组成中各有机溶剂的蒸气比例发生变化, 含水的展开剂在放置过程中或展开时有机相中的水的比例不同, 不同程度地改变了展开剂的极性, 从而影响到色谱的分离度[3]。
 
对温、湿度敏感的品种, 必须按照品种项下的规定, 严格控制实验环境的温、湿度。
3 讨论
 
随着科学技术的迅速发展, 薄层色谱技术日新月异, 已由传统的普通薄层色谱发展到现在的高效薄层色谱 (HPTLC) 、微乳薄层色谱 (METLC) 、棒状薄层色谱 (TLC-FID) 、加压薄层色谱 (OPLC) 、离心薄层色谱 (CTLC) 、胶束薄层色谱 (M-TLC) 、包合薄层色谱 (ICC) 、二维薄层色谱 (2D TLC) 、超薄层色谱 (UTLC) 等, 并逐步向联用检测方向发展, 如薄层色谱-质谱联用、薄层色谱-红外联用、薄层-生物自显影、薄层色谱-拉曼光谱联用、薄层色谱-核磁共振联用检测等[4,5,6,7,8], 科学家们研发出愈来愈先进的仪器设备, 致力于控制影响色谱行为的个人因素和环境因素。随着薄层色谱规范化和自动化水平的提高, 薄层色谱法将日趋高效、准确、灵敏, 从而在药物分析中发挥出更广泛更出色的作用。
 
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