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中药薄层色谱仪影响因素分析及应用

薄层色谱仪是中药鉴别、中药成方制剂质量标准主要的研究和控制手段之一,其研究质量对中药成方制剂新药项目的质量标准意义十分重要。薄层色谱鉴别在我国各版药典中的应用增幅较大,如2005年版药典共收载1 507项,2010年版药典仅新增就达2 494项,且除矿物药外均有专属性强的薄层色谱鉴别方法。另外,中药复方新药研制的质量标准研究资料基本上采用了以对照药材作对照的薄层色谱鉴别,说明薄层色谱技术在中药分析与检验上占着重要的地位。虽然在制订药品标准时倾向于应用液相色谱技术,但薄层色谱因操作简便、设备简单、成本相对低廉、分离快速,在中药鉴别领域仍被广泛应用。

1 基本方法与原理

薄层色谱鉴别时,将样品溶液用毛细管点于薄层板的一端,置密闭槽中,加入适宜溶剂作为流动相,由于毛细管原理,溶剂被吸上、沿板移动,并带动样品中各组分向前移动,这个过程称为展开。由于各组分性质不同,移动距离不同,展开一定距离后,可得到互相分离的组分斑点?捎檬实狈椒ㄊ垢髯榉衷诎迳舷允酒湮恢,若组分本身有颜色,即可直接观察,否则可喷显色试剂或在紫外灯下观察荧光等方法确定斑点位置。其分离原理是利用各成分对同一吸附剂的吸附能力不同,使在移动相(溶剂)流过固定相(吸附剂)的过程中,连续地产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附,从而使各成分互相分离。根据固定相不同,可以分为硅胶(G板、硅胶H板等)、聚酰胺、纤维素、离子交换剂、氧化铝等薄层色谱。

2 影响因素及应对方案

2.1 温度

一般情况下,温度高,Rf值也高。温度主要影响有机溶剂的蒸发程度,影响展缸中各蒸气的比例,从而改变了展开剂的比例[1]。要解决温度对薄层色谱的影响,只能是控制展开时的温度,如在冰箱或密封可控温的装置中进行展开试验。

 

2.2湿度

湿度可能主要影响薄层板的吸附能力,导致选择性(容量因子)的变化。湿度应根据实际情况确定。为保持薄层色谱结果的重现性,可在展开缸的一端加入不同比例的硫酸?刂剖人璧牧蛩峋咛灞壤刹慰急1。

表1 不同湿度所需的硫酸比例(V/V)    下载原表

表1 不同湿度所需的硫酸比例(V/V)

2.3 展缸和薄层板

展缸和薄层板是否饱和对生物碱类成分的薄层鉴别影响比较大。例如,苦参药材薄层色谱鉴别时,展缸氨水饱和与未饱和后展开的色谱图见图1?杉,展缸和薄层板经饱和后展开的色谱图斑点清晰、圆整,而未饱和展开的色谱图斑点拖尾严重、边缘效应较大。为此,笔者试验了3种不同的展开条件:在展开剂中加入少量的氨水,在展开缸的另一端加入氨水,薄层板制备时加入0.1%的氢氧化钠使薄层板为碱性。结果这3种方法均能达到饱和展缸和薄层板的目的,其色谱斑点清晰、圆整、分离良好。

图1 展缸和薄层板是否饱和对薄层色谱的影响

 

2.4 样品处理

中药成分复杂,特别是中药复方成分更是复杂多样,不同成分之间相互干扰严重,难以得到满意的分离效果,因此样品处理对于中药的薄层色谱鉴别至关重要。对于某些成分如皂苷类,经过多次分离纯化处理后,薄层色谱斑点清晰、分离较好且背景较浅。图2为某复方制剂样品经不同方法处理后的薄层色谱图。

图2 样品处理对薄层色谱的影响

 

1.脱脂后甲醇提取、直接点样2.正丁醇萃取3.过柱后进行正丁醇萃取4.人参对照药材5.甘草对照药材

2.5 其他因素

不同厂家的薄层板:不同厂家所用的硅胶粒度、性质,黏合剂和制作技术有所不同,都会导致色谱行为产生差异,手铺板则更为明显。因此,试验时一定要做好详细记录,包括薄层板的类型、厂家温度、湿度等相关信息,以保证薄层色谱结果的重现性。

操作者的经验和操作:新手操作的薄层色谱图边缘效应严重、斑点拖尾,而有经验者操作的薄层色谱图无边缘效应、斑点无拖尾现象。说明在做薄层鉴别的过程中要不断地试验,总结经验。

展开剂的使用次数:展开剂多次使用后,色谱斑点明显减少,主要是由于展开剂的比例发生了变化。因此在做薄层展开时,展开剂要用新鲜的,不能重复使用。

3 操作注意事项

3.1 自制薄层板

黏合剂配制:常用的黏合剂为羧甲基纤维素钠(CMC-Na),在溶解过程中,应将其少量地撒于水的表面,自然沉降、充分浸润,溶胀之后可加热溶解,若不急于使用则可直接浸泡至溶解。需要注意的是,黏合剂用前一定要过滤,所铺的板子才会均匀。

铺板:将黏合剂与固定相用的吸附剂按一定比例混合,向一个方向研磨,速度不宜快,要顺着研钵的边缘研磨并仔细观察,一定要把气泡排除,稠度以用研棒粘取呈连珠状而不呈线状下滴为好。研匀后,采用手铺或者铺板器铺制薄层板。

干燥:铺好后的板子要置于平面上晾干,否则难以保证板面硅胶的厚度均匀。用前再于105℃活化30 min。

3.2 展开

点样:一般采用微升毛细管点样,也可用自动点样器。在薄层板点样的斑点一般呈圆点状或窄细的条带状;点样基线距底边15~20 mm,高效板一般为8~10 mm;圆点状直径一般不大于5 mm,高效板一般不大于3 mm;条带状宽度一般为5~10 mm,高效板一般为4~8 mm?捎米ㄓ冒胱远蜃远阊餍蹬缥矸ǖ阊,点间距离可视斑点扩散情况而定,以不影响检出为宜,一般不少于8 mm,高效板不少于5 mm。

展开剂:展开剂要求新鲜配制,不要多次反复使用,若需分层,则应按要求放置分层后取所需的一相(上层或下层)备用。选择展开剂的依据是溶剂的极性大小,极性大的化合物需用极性大的展开剂,极性小的化合物需用极性小的展开剂。在实际工作中,常用两种或3种溶剂的混合物作展开剂,这样更有利于调整展开剂的极性,以改善分离效果。Rf值应在0.2~0.7范围内。展开剂根据其极性大小可分为3种,弱极性溶剂体系的基本相由正己烷和水组成,再根据需要加入甲醇、乙醇、乙酸乙酯来调节溶剂系统的极性,适用于生物碱、黄酮、萜类成分的分离;中等极性溶剂体系的基本相由氯仿和水组成,以甲醇、乙醇、乙酸乙酯等来调节极性,适用于蒽醌、香豆素以及一些极性较大的木脂素和萜类成分的分离;强极性溶剂体系由正丁醇和水组成,也是用甲醇、乙醇、乙酸乙酯等来调节,适用于极性很大的生物碱类成分的分离。

展开试验:应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸,并有严密的盖子,底部应平整光滑,或有双槽。上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸,展开时须能密闭。水平展开应用专用的水平展开缸。展开前如需溶剂蒸气预平衡,可在展开缸中加入适量的展开剂,密闭15~30 min,溶剂蒸气预平衡后应迅速放入载有供试品的薄层板,立即密闭,按照要求展开。

3.3 显色

首先应根据被检测的化学成分选择合适的显色剂。如果成分未知,可用硫酸进行显色,因有机碳水化合物均可与稀硫酸进行氧化还原反应,按氧化的程度不同而显不同的颜色或荧光;或可采用用铁氰化钾-三氯化铁试剂对还原性物质显蓝色等。如果成分明确,可选择专属性较强的颜色反应显色剂,如黄酮类选择三氯化铝乙醇溶液,氨基糖类选用对二甲氨基苯甲醛,醛酮类选用2,4-二硝基苯肼等。

3.4 结果检视

复核检验:按照标准操作即可。常有两种方法,日光下直接检视或喷显色剂后日光下检视,如含有皂苷、三萜皂苷、生物碱类成分的药材等;紫外光(254 nm或365 nm)下检视或喷显色剂后在紫外(254 nm或365 nm)下检视,如含有香豆素类、蒽醌类、黄酮类成分的药材等。

摸索试验或预试验:其结果检视也有一定的技巧可循。一般检视的顺序为,先在日光或紫外光(254 nm和365 nm)下检视;再喷以不破坏化学成分的显色剂(如氨熏、碘熏等),日光下检视后,再于紫外光(254 nm或365 nm)下检视;喷以可破坏化学成分的显色剂(茚三酮试液、香草醛试液等),日光下检视后,再于紫外光(254 nm或365 nm)下检视。这样,一块薄层板就可以得到9种不同条件下的色谱信息。这些大量的薄层斑点,多表示了性质不同的化学成分,虽有重叠,但在各自的检视条件下却互不干扰,呈现各自的斑点特征。如将当归和川芎的样品溶液分别点于同一块薄层板上,展开后在紫外光灯(365 nm)下检测均呈现共有的亮兰色斑点;然后在紫外光灯(254 nm)下检视,川芎比当归多显1个荧光熄灭斑点;再喷以三氯化铝乙醇溶液,置紫外光灯(365 nm)下检视,当归增加了另一个特征性荧光斑点;再喷以香草醛硫酸乙醇溶液后检视,当归比川芎又多一个棕褐色斑点(图3)[2]。

图3 当归、川芎的检视图

 

4 应用

4.1 丹参

取本品粉末1 g,加乙醚5 m L,振摇,放置1 h,滤过,滤液挥干,残渣加乙酸乙酯1 m L使溶解,作为供试品溶液。另取丹参对照药材1 g,同法制成对照药材溶液。再取丹参酮ⅡA对照品,加乙酸乙酯制成每1 m L含2 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各5μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以苯-乙酸乙酯(19∶1)为展开剂,展开,取出,晾干。供试品溶液色谱中,在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点,在与对照品溶液色谱相应位置上显相同的暗红色斑点(图4 A)[3]。

取本品粉末0.2 g,加75%甲醇25 m L,加热回流1 h,滤过,滤液浓缩至1 m L,作为供试品溶液。另取丹酚酸B对照品,加75%甲醇制成每1 m L含2 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各5μL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品溶液色谱中,在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点(图4 B)。

图4 丹参薄层色谱图

 

4.2 何首乌

取本品粉末0.25 g,加乙醇50 m L,加热回流1 h,滤过,滤液浓缩至3 m L,作为供试品溶液。另取何首乌对照药材0.25 g,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各2μL,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上使成条状,以苯-乙醇(2∶1)为展开剂,展至约3.5 cm,取出,晾干,再以苯-乙醇(4∶1)为展开剂,展至约7 cm,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中,在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光条斑。再喷以磷钼酸硫酸溶液(取磷钼酸2 g,加水20 m L使溶解,再缓缓加入硫酸30 m L,摇匀),稍加热,立即置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中,在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的条斑(图5)。

图5 何首乌薄层色谱图

 

4.3 决明子

取本品粉末1 g,加甲醇10 m L,浸渍1 h,滤过,滤液蒸干,残渣加水10 m L使溶解,再加盐酸1 m L,置水浴上加热30 min,立即冷却,用乙醚提取2次,每次20 m L,合并乙醚液,蒸干,残渣加三氯甲烷1 m L使溶解,作为供试品溶液。另取大黄素对照品、大黄酚对照品,加甲醇制成每1 m L各含1 mg的混合溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各2μL,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上,以石油醚(30~60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中,在与对照品溶液色谱相应位置上显相同的橙色荧光斑点,置氨蒸气中熏后斑点变为红色(图6)。

图6 决明子薄层色谱图

 

4.4 山楂

取本品粉末1 g,加乙酸乙酯4 m L,超声处理15 min,滤过,滤液作为供试品溶液。另取熊果酸对照品,加甲醇制成每1 m L含1 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各4μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20∶4∶0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以硫酸乙醇溶液(3→10),在80℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中,在与对照品溶液色谱相应位置上显相同的紫红色斑点;置紫外光灯(365 nm)下检视,显相同的橙黄色荧光斑点(图7)。

图7 山楂薄层色谱图

 

5 发展前景

薄层色谱设备简单、操作方便、适用性广,可以快速给出可靠、准确的结果等特点,一直被很多分析工作者所关注,并被用于多个领域。随着科学技术的迅速发展,薄层色谱技术日新月异,已由传统的普通薄层色谱发展到现在的高效薄层色谱、棒状薄层色谱(TLC-FID)、加压薄层色谱(OPLC)、离心薄层色谱(CTLC)、胶束薄层色谱(M-TLC)、包合薄层色谱(ICC)、二维薄层(2D TLC)、超薄层色谱(UTLC)等;而且,薄层色谱也与现代高科技的分析技术相结合,如薄层色谱-傅立叶变换红外光谱联用检测、薄层色谱-拉曼光谱联用检测、薄层色谱-质谱联用检测、薄层色谱-核磁共振联用检测、薄层色谱-电化学方法联用检测等,使其成为一种灵敏、高效的分离与分析方法。今后,薄层色谱法仍将是可供选择的经济、可靠、快速的重要分析方法之一。

 


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