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拉曼光谱应用技术研究

 
 
拉曼光谱法是上世纪20年代由印度科学家拉曼提出来的一项技术。上世纪60年代激光器的诞生, 给拉曼光谱的应用带来了发展空间。拉曼光谱分析技术由于具有丰富的物质特性信息、无损检验、无需样品制备等优点, 作为一种行之有效的检测分析方法目前已被广泛应用[1,2,3], 是现代分析技术的重要组成部分。早期的拉曼光谱仪体积较大且安装不方便, 主要应用于实验室中, 随着光电、嵌入式软硬件、拉曼光谱分析技术的不断进步, 体积小、重量轻、移动方便的手持便携式拉曼光谱仪具有检测快速准确等优点, 迅速得到了发展, 市场需求不断增加。世界上各知名光谱仪生产厂家相继推出了多种型号的便携式拉曼光谱仪。由于目前我国还没有自主生产手持式拉曼光谱仪的能力, 手持式拉曼光谱仪市场已被国外厂商所垄断, 因此, 研制我国拥有独立自主知识产权的手持式拉曼光谱仪系统, 并加强应用推广, 对打破国外在该领域的垄断、提高我国核心技术竞争力具有重要意义。
2 拉曼光谱仪
 
拉曼光谱仪是利用拉曼光学原理及现代先进电子技术设计的光电仪器, 主要进行拉曼光谱研究和物质结构分析。根据光谱获取的不同方式, 拉曼光谱仪可以大致分为3种类型:滤光器型拉曼光谱仪、色散型拉曼光谱仪及傅里叶变换型拉曼光谱仪。滤光器型拉曼光谱仪是最早的一种拉曼光谱仪, 该种拉曼光谱仪采用滤光器作为波长选通器件, 使拉曼光谱中某些很窄波段内的光通过, 探测其强度, 得到光谱。这种仪器的缺点是来自样品的拉曼散射光绝大部分都被滤光器所阻挡, 能量利用率低, 测量时间长。色散型拉曼光谱仪采用光栅作为分光元件, 将拉曼散射光分光后输出至探测面, 由多通道探测器 (如:CCD) 同时接收各个波长的光的强度, 得到拉曼光谱。这种拉曼光谱仪的优点是测量时间短。傅里叶变换型拉曼光谱仪采用干涉仪代替分光仪, 将拉曼散射光输入迈克尔逊干涉系统, 由探测器接收其干涉图, 再对干涉图做傅里叶变换反演出拉曼光谱。目前, 主流拉曼光谱仪是色散型及傅里叶变换型拉曼光谱仪。色散型拉曼光谱仪可以做到小型化, 手持拉曼光谱仪一般为色散型, 且色散元件通常为光栅[4,5]。
 
根据光谱仪激发光源波长分类, 拉曼光谱分析的激光器激发光源从紫外、可见到近红外波长范围, 典型的激光器有 (不限于) :紫外光:244nm、257nm、325nm、364nm、可见光:457nm、488nm、514nm、532nm、633nm、660nm;近红外光:785nm、830nm、980nm、1064nm。激光波长的选择对于实验的结果有着重要的影响。目前基于可见光和红外光激光器的拉曼光谱仪较为普遍, 紫外光由于激光源技术难度以及成本相对较高应用相对少。
 
拉曼光谱测试系统如图1所示, 主要由以下几部分组成。
图1 拉曼光谱仪测试原理
 
采样样品:分析物质结构的被测物品, 包括各种固体、液体、气体、有机物、高分子、无机物、高聚物、生物等。
 
拉曼探头:包含滤光片、光纤, 能够很好地收集信号, 有效滤除瑞利散射信号, 并具有紧凑、耐用的探头设计。不同的探头具有不同的激励波。测量时, 需要通过配备不同采样支架, 可以针对形态分别为固体、液体或粉末状的样品进行检查。
 
激光器:常用的有Ar离子激光器、Kr离子激光器、He-Ne激光器、Nd-YAG激光器、二极管激光器等。拉曼激发光源波长有:325nm (UV) 、488nm (蓝绿) 、514nm (绿) 、633nm (红) 、785nm (红) 、1064nm (IR) 。
 
光谱仪:包含激光器, 探测器等, 并具有计算机控制和数据处理功能的仪表。
 
分析软件:主要为实现拉曼光谱的信息采集、降噪、分析、存取、数据库读取以及拉曼光谱识别等功能。该软件主体包括:界面设计、光谱采集、分析和处理、数据结构、数据库编辑等界面。
3 拉曼光谱数据处理技术
 
原始的拉曼光谱包含荧光、各种干扰源等噪声, 对测量造成极大影响。拉曼光谱数据处理技术是指在对样品进行定性、定量分析之前对所测光谱进行消除荧光、噪声的处理, 为拉曼光谱物质鉴别提供可靠有效的数据, 以获得稳定、可靠的分析结果。
 
传统的拉曼光谱仪, 采用可见激光作为激发光源, 比较容易产生荧光效应, 荧光的光强比拉曼散射强度大好几个数量级, 因而强的荧光背景通常会将拉曼谱带全部淹没, 近红外以及紫外激光光源虽然能有效的抑制荧光效应, 但是当样品分子的电子能级间隔和激发光源光子能量相近时, 也会出现明显的荧光效应, 因此在实际测量中, 对荧光进行抑制措施是十分必要的。此外, 实际测量时, 拉曼光谱中还存在着多种干扰源, 主要有激光及拉曼散射光的发射噪声、CCD探测器的散粒噪声、暗电流噪声及读出噪声、样品、样品容器等的荧光和磷光背景、样品及其周围环境的黑体辐射、环境中射线导致的尖峰等等。这些干扰源会给后续的分析结果带来不准确性及不稳定性。所以, 为了获得有效待测物品光谱, 首先要对测的原始光谱进行有效的去荧光效应, 去噪声处理, 同时还要对被测物质光谱进行特征谱分析, 实现物质鉴别。
3.1 去荧光效应技术
 
针对荧光效应问题, 各国学者提出并实现了多种荧光抑制方法和技术。这些方法利用了拉曼散射光和荧光在诸多方面的特性差异, 如偏振特性、时间/寿命特性、对激发波长的依赖性等。在拉曼光谱检测中常用的荧光抑制方法主要有荧光淬灭剂法、光漂白法、红外/紫外激发法、偏振调制法、移频激发法、高频调制法、门控法、数值处理法以及非线性效应法等[6,7]。典型的荧光数据处理方法有以下几点。
 
荧光猝灭剂法:是传统的一种方法, 该方法需要向样品中添加一定的荧光猝灭剂, 利用荧光猝灭剂分子与样品分子间发生物理化学反应来降低样品分子的荧光发射强度, 达到抑制荧光的目的。Friedman和Hochstasser在检测荧光时发现, 没有添加荧光淬灭剂 (碘化钾) 时观察不到拉曼峰, 添加淬灭剂后可以清楚地观察到拉曼特征谱[8]。该方法成本低、操作简便, 但是加入淬灭剂可能影响待测样品的拉曼谱, 因而应用范围受到较大的限制。
 
光漂白法:需要用激光对样品预先照射一段时间, 使得荧光分子发生化学变化, 从而降低荧光发射强度, 然后对感兴趣的分子结构进行拉曼检测。Mac Donald和Wyeth等人采用这种方法对红丹颜料进行检测时发现荧光背景噪声与预先照射的时间近似成指数衰减关系, 光漂白后可以清楚地观察到一些小的拉曼峰[9]。
 
偏振调制法:是基于拉曼与荧光的偏振特性不同提出的, 荧光大多是非偏振光, 而拉曼光是部分偏振光, 采用偏振检波器, 将光分成两路, 一路进入单色仪作为输入信号, 另外一路作为参考信号, 利用锁定放大器进行检测, 可以充分区分开荧光与拉曼光。
 
移频激发法:基于拉曼光谱与荧光光谱对激发光波长的依赖程度不同而提出的。在一定的范围内, 荧光光谱几乎不会随着激发光波长的变化而变化, 相反拉曼光谱却会紧密跟随激发光波长的变化而发生移动。若采用两个波长相近的激光分别激发样品, 得到两组散射谱, 再利用差分方法, 得到两个散射谱的差值谱, 则在该差值谱中荧光的光谱信号几乎被完全消除, 而拉曼信号却能够保留下来。
 
数值处理法:数值拟合是常用的光谱数据处理方法, 包括:频域滤波、小波变换、曲线拟合等。这方面有许多学者提出了各种算法, 如:平方拟合、高斯拟合、高次多项式拟合、自校正拟合甚至更复杂的算法设计。频域滤波法是对拉曼光谱测量数据进行傅里叶变换, 然后在频域中设计合适的滤波器进行滤波处理的方法。由于荧光光谱与拉曼光谱的谱线宽度不同, 有着不同的傅里叶频谱特征, 所以可以在频域中进行适当的滤波来区分拉曼谱与荧光谱。Cai等人对萘普生样品进行拉曼检测后利用小波变换进行处理得到了较好的结果[10], 一些被荧光背景噪声与随机噪声所淹没的弱拉曼峰可以分辨。小波变换法快捷实用, 但是选择不同的小波多层分解方法和不同的阈值参数, 得到的结果存在不一致的问题。此外, 由于荧光谱表现为较平缓的形状, 因此可以采用曲线拟合的方法来逼近然后进行消除, 得到剩下的拉曼信号。文献[8]提出了一种基于信号极小极大值自适应缩放的消除荧光背景方法, 从峰强与质量分数关系、单光谱与混合光谱关系两个方面验证了可行性。
3.2 去噪声数据处理技术
 
拉曼有效信号容易被各种噪声所淹没, 所以需要对测得拉曼光谱进行去噪声处理, 以提高光谱信噪比。针对光谱的去噪声, 科研人员提出了众多的方法[4], 目前较为常用的拉曼光谱去噪方法主要有:滑动窗口平均法、滑动窗口中位值法、SavitzkyGolay滤波法和小波阈值滤波法。
(1) 滑动窗口平均法
 
滑动窗口平均法 (Moving Window Average, MWA) 采用一个窗口沿着光谱向量平移, 逐一求取窗口内元素的算术平均值, 替代原始光谱中窗口中心位置处的元素, 即可得到降噪的光谱。设其宽度为2m+1, 原始光谱为S, 平滑后的光谱为S′, 有 (1) 式。
 
(2) 滑动窗口中位值法
 
滑动窗口中位值法 (Moving Window Median, MWM) 与滑动窗口平均法相似, 采用一个窗口沿着光谱向量滑动。不同之处在于, 对窗口内部的元素取中位值实现光谱的降噪。
(3) Savitzky-Golay滤波法
 
S avit zky-G olay滤波法 (S avit zky-G olay Filter, SGF) 由Abraham Savitzky和Marcel J.E.Golay于1964年提出。该方法也是通过一个移动窗口, 对窗口内部元素做多项式最小二乘拟合, 得到窗口中心位置处元素平滑后的值。该方法既能够实现良好的去噪效果, 又可以较好地保留图谱信号中的有用信息, 因此在各种化学图谱信号分析中获得了广泛的应用。
(4) 小波阈值滤波法
 
小波阈值滤波法 (Wavele tThresh old i n g Denoise, WTD) , 由于对含噪信号做小波变换后, 噪声引起的小波系数主要集中在小尺度上, 且其幅值随着尺度增加迅速减小, 而有用信号引起的小波系数主要集中在各尺度中少数的位置上, 且幅值较大, 可利用这个特点对含噪信号进行滤波, 设置一个阈值, 认为小于该阈值的小波系数是噪声所引起, 将其归零, 大于该阈值的小波系数是有用信号所引起, 将其保留或者做某种收缩, 然后对处理过的小波系数做小波逆变换, 重构出去除噪声的信号。
(5) 循环三点零阶Savitzky-Golay滤波法
 
常用的去噪方法中, 滑动窗口平均法、滑动窗口中位值法都需要设定滑动窗口的宽度, SavitzkyGolay滤波法需要设定滑动窗口的宽度和多项式拟合的阶数, 小波阈值滤波法需要选择小波的种类、确定阈值的方法、对小波系数进行阈值处理的规则 (是硬阈值还是软阈值) 、分解的层数等因素。因此这些方法无法实现光谱去噪的自动化, 对于手持式拉曼光谱仪中光谱的降噪并不适用。H.Georg Schulze提出了一种循环三点零阶Savitzky-Golay滤波法[11]。三点零阶Savitzky-Golay滤波实际上就是窗口宽度为3的滑动窗口平均滤波, 由于窗口宽度已是最小, 每次循环滤波所滤除的噪声的量也最少, 通过循环使用三点滑动窗口平均法对光谱进行滤波, 缓慢地去除原始光谱中的噪声。该方法不需要人工设置任何参数, 可实现光谱降噪的完全自动化。
(6) 去尖峰噪声方法
 
测量拉曼光谱时, 若宇宙射线或者环境中物质发出的α射线及γ射线照射到探测器上, 会形成一系列非常尖锐的峰型, 其宽度通常不超过2cm-1, 称为尖峰。尖峰作为噪声的一部分也需要去除。研究人员提出了多种去尖峰方法[4,12,13], 如:G.R.Phillips等提出的缺点多项式滤波器法 (Missing-Point Polynomial Filter, MPPF) 、William S.Cleveland提出的鲁棒局部加权回归法 (Robust Locally Weighted Regression, RLWR) , Yukiteru等提出的循环消去法 (Iteratively Stripping, IS) 等等。
3.3 拉曼光谱谱峰识别技术
 
拉曼光谱信息蕴藏于拉曼谱峰之中, 因此拉曼谱峰识别是拉曼光谱定性分析中至关重要的一个环节。
 
目前, 拉曼谱峰识别研究最普遍的方法是连续小波变换法 (Continuous Wavelet Transform, CWT) 识别谱峰, 该方法通过在小波系数矩阵中搜索谱峰引起的局部极大值形成的脊线来识别谱峰。该方法需要确定脊线长度阈值及脊线信噪比阈值, 无法实现自动化识别谱峰, 且谱峰识别准确率、峰位定位准确度不高。文献[4]提出的基于双尺度相关运算的拉曼谱峰识别方法 (Bi-Scale Correlation, BSC) 和基于多尺度局部信噪比的拉曼谱峰识别方法 (Multiscale Local Signal to Noise Ratio, MLSNR) 。BSC法采用大、小两个尺度的参考峰分别与被检光谱做滑动相关运算, 得到两个尺度下的相关系数, 并求取在两个尺度下的局部信噪比, 认为相关系数和局部信噪比大于各自阈值的局部极大处存在拉曼谱峰。MLSNR法通过对光谱进行多尺度二阶差分运算, 得到光谱的差分系数, 再将差分系数除以估计出的噪声标准差, 获得光谱的多尺度局部信噪比矩阵, 通过寻找矩阵中的局部极大值形成的脊线来识别谱峰。采用自动阈值估计法去除噪声引起的脊线的干扰, 不需设置任何参数。
3.4 拉曼光谱判别分析技术
 
拉曼光谱的判别分析技术是指利用未知样品的拉曼光谱来判断样品的归属的一项技术, 属于化学计量学中的模式识别问题。化学计量学中的模式识别方法大致可以分为有管理的方法 (判别分析法) 、无管理的方法 (聚类分析法) 、基于特征投影的降维显示法等。有管理方法通过对某类样品采样得到该类样品的训练集, 利用此训练集来对该类样品进行类的定义, 通过判断未知样品是否满足该定义来对未知样品进行识别。为了能够保证类的定义的准确性, 采样所得到的训练集应该能够非常好地表征该类样品的所有特征。无管理方法不需要采集训练集, 其核心思想是属于同一类的样品在其特征空间中应该具有较近的距离, 即物以类聚, 将距离较近的样品归为一类, 以达到识别的目的。基于特征投影的降维显示法是指通过对样本的特征向量进行降维, 对降维的数据进行显示, 利用人脑强大的分析能力对所处理的样本进行识别和分析。
 
便携拉曼光谱仪中的样品识别一般采用的是有管理的方法, 即通过训练集对各类进行定义, 建立由各类样品定义组成的数据库, 对未知样品识别时, 将其光谱与数据库中的类逐一进行比较, 依据样品特征与各类的符合程度来对其进行判别分析。便携拉曼光谱仪中常用的样品识别方法为直接匹配法和基于簇类的软独立模型法[4]。
4 拉曼光谱应用
 
拉曼光谱的分析范围几乎覆盖了所有的有机、无机化合物, 高分子及其混合物, 这使其应用范围已不再局限于物理学和化学领域的理论研究, 而以很快的速度从各个学科分支拓展到材料、化工、生物医学、环!⒖脊拧⒌刂室灾辽堂澈托淌滤痉ǖ裙惴旱挠τ眯幸盗煊。
 
拉曼光谱的具体行业应用包括:在石油领域可以检测石油产品质量、定性分析石油产品组成或种类;在食品领域用于食品成分的“证实”, 以及掺杂物的“证伪”;在农牧领域, 进行农牧产品的分类及鉴定;制药及医学相关领域的质量控制、成分鉴定、药物鉴别、疾病诊断;在刑侦及珠宝行业进行毒品检测、珠宝鉴定;在环境保护方面, 环保部门水质污染监测、表面污染检测和其他有机污染物;物理领域的光学器件和半导体元件研究;地质领域进行现场探矿、矿石成分的定量定性分析和包裹体的研究等。典型应用如下。
 
在化工生产领域, 拉曼检测可以实时监控高分子聚合过程和鉴定混合物中各种成分的含量。Bauer等人利用拉曼光谱测定了苯乙烯单体在乳液聚合反应中的浓度变化情况[14], Wenz等人用拉曼光谱分析技术来监测ABS塑料生产的接枝共聚过程[15]。Otakar等人将拉曼光谱与化学计量学方法结合快速测定油品的物化参数[16], 如:汽油的辛烷值、蒸气压、苯含量、氧含量和密度, 柴油的十六烷值和十六烷值指数, 重油的API度, 石脑油中的族组成和密度。
 
在有机化学测试中:拉曼光谱在有机化学方面主要是用作结构鉴定的手段, 拉曼位移的大小、强度及拉曼峰形状是确定化学键、官能团的重要依据。利用偏振特性, 拉曼光谱还可以作为顺反式结构判断的依据。
 
对生物检测应用方面:拉曼光谱是研究生物大分子的有力手段, 由于水的拉曼光谱很弱、谱图又很简单, 故拉曼光谱可以在接近自然状态、活性状态下来研究生物大分子的结构及其变化。拉曼光谱在蛋白质二级结构的研究、DNA和致癌物分子间的作用、视紫红质在光循环中的结构变化、动脉硬化操作中的钙化沉积和红细胞膜等研究中的应用均有文献报道。
 
在环境保护应用中, 拉曼检测可用于水质分析, 而且检测的物质范围非常广, 现有的研究成果中包括氰化物、铁氰化物、硝酸盐和亚硝酸盐、硫酸盐等各种无机物以及苯类、酚类、醛类、喹啉、吡啶、含氮芳香化合物等各种有机物的检测, 可以用来获取水环境的污染信息[17]。
 
在材料方面的应用, 在相组成界面、晶界等课题中有很多应用。最近, 对于拉曼光谱在金刚石和类金刚石薄膜的研究工作中的应用, 国内外学者的兴趣有增无减。拉曼光谱已成CVD (化学气相沉积法) 制备薄膜的检测和鉴定手段。另外, 二氧化硅薄膜氮化的拉曼光谱研究都已见报道。
5 结语
 
拉曼光谱法作为一种快速、无损、安全的检测技术, 特别其小型化便携式光谱仪的应用在各个行业越来越广泛。在实际应用中, 由于拉曼光谱本身信号微弱, 同时受到荧光干扰、噪声干扰、谱峰识别、光谱判别等问题, 想要得到高质量的拉曼光谱信号, 相关的技术难点和方法必须得到有效解决, 其诸多技术问题已经成为科学研究的热门课题之一。为了满足各行业的有效应用, 研制出具有自主知识产权的高质量高效能的小型化便携式拉曼光谱仪, 提高国际竞争力, 我国相关领域的科研工作者责任重大, 任重道远。
 
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