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表面增强拉曼光谱技术在食品安全检测中的应用研究进展

 
 
“民以食为天, 食以安为先”, 与生命健康息息相关的食品安全问题不仅是民众生活的底线, 更是国家发展的基础和人类发展的要求。然而, 自2000年之后, “瘦肉精”、“苏丹红”、“毒黄瓜”、“染色馒头”、“地沟油”、“三聚氰胺”、“塑化剂”、“速生鸡”等重大食品安全事件被曝光, 引发了公众对食品安全问题的强烈关注。食品安全恶性事件的频现, 给我国经济和人民生命财产造成重大损失。这主要与我国目前的食品安全法律不健全、食品安全监管不力和食品安全监测技术及设备落后等现状有关。针对食品安全问题, 目前国际上常用的检测方法多为仪器分析法, 仪器法虽可以满足精准检测的要求, 但样品前处理较复杂、成本高、耗时长, 无法满足现场样品高通量的快速筛查要求。而快检分析法因能弥补仪器法的不足, 以及低成本实现样品的现场快速检测, 逐渐成为食品安全检测的热门技术。
 
表面增强拉曼光谱 (Surface Enhanced Raman Spectroscopy, SERS) 技术作为一种新型的快速检测技术, 承载了丰富的化学指纹信息, 具有灵敏度高、荧光背景低、不受水干扰, 可实现痕量无损检测、便携式设备等优点。其检测是基于在合适频率的入射光照射下, 吸附在SERS基底上的分子与金属表面等离子体发生等离子共振而引起分子拉曼散射明显增强的原理[1]。上述特点使得SERS成为一种强有力的分析检测技术, 在环境监测[2]、食品安全[3]、生物技术[4]、表面科学[5]等领域显示出巨大的应用潜力。基于近红外波长激光的SERS技术能达到单分子检测[6]水平, 该技术在食品安全检测方面得到日益广泛和深入的研究。本文介绍了表面增强拉曼光谱技术的发展历程、增强机理、基底的分类及应用和检测模式, 对SERS检测技术在食品中有害小分子物质、食源性致病菌、重金属污染和真菌毒素等领域的应用进展进行了综述, 并对目前存在的问题和今后的研究趋势进行了总结和展望。
1 SERS的发展历程
 
拉曼散射最早由印度物理学家拉曼 (C.V.Raman) 于20世纪20年代末发现。然而, 早期拉曼光谱的应用因拉曼谱线强度弱和检测灵敏度有限而受到限制。直至60年代激光器的产生, 近红外波长激光代替可见光的使用有效避免了在可见光下的荧光干扰问题, 攻克了拉曼光谱信号弱的不足。1974年英国南安普顿大学的Fleischmann等[7]研究吡啶分子在粗糙银电极基底上的拉曼光谱时, 发现吡啶分子的拉曼信号被大大增强, 得出通过某种方式可以增强待测物拉曼信号的结论, 但未进一步探讨其增强机制。1977年Van Duyne[8]和Creighton等[9]对Fleischmann的实验结果进行系统分析, 得到了粗糙银电极是增强吡啶分子拉曼信号的主要原因, 使拉曼光谱获得突破性进展。此后, 人们将这种分子吸附于特定金属表面而使拉曼信号大大增强的现象称为表面增强拉曼散射 (SERS) 。
 
B: (1) ceation of an e-h pair in the metal (在金属中创建e-h对) ; (2) tunneling of the hole from the metal to the molecule (空穴从金属转移到分子中) ; (3) tunneling of the hole back to the metal (空穴又回到金属) ; (4) recombination eletron and hole to give all emitted photon (电子-空穴的复合产生激发光子)
图1 球形金属纳米颗粒表面等离子体共振[11] (A) 与光驱电荷转移模型[12] (B) 示意图Fig.1 Schematic illustration of surface plasmon resonance for a mental sphere[11] (A) and schamatic diagram of the photo-driven charge-transfer mode[12] (B)
 
 
1.1 SERS的增强机理
 
虽然SERS的应用非常广泛, 但其复杂的增强机理至今尚未完全清楚, 目前人们认同的增强机理有物理增强和化学增强两种。物理增强即电磁场增强机理, 主要受金属表面等离子体共振 (图1A) 导致的局域电场增强影响;化学增强即电荷转移机理, 主要受金属与分子间的电荷转移 (图1B) 所导致的极化率改变影响, 要求分子与基底之间的距离足够近[10,11,12]。根据报道, SERS效应是两者共同作用的结果, 但化学增强的增强因子一般在100倍左右, 贡献较小, 其主要贡献是来源于纳米结构的等离子体共振引起的电磁增强, 理论上增强因子可达到1014倍, 但对于SERS增强机理的普遍适用尚需进一步探索。常见的SERS增强材料有贵金属、过渡金属、半导体、量子点和石墨烯等, 其中贵金属具有较强的电磁增强作用, 而半导体、量子点和石墨烯只有化学增强作用。然而, 不论是何种增强效果, 金属表面必须具有合适的粗糙程度, 纳米基底的粒径、形貌和分布状况对SERS的增强效应也起着举足轻重的作用。这大大激发了人们开发纳米结构的SERS活性基底的兴趣。
1.2 SERS基底的分类
 
近年来, 研究者通过物理和化学方法控制纳米结构的形状、尺寸和组成, 致力于制备各种优异的SERS基底。目前, 制备SERS活性基底的材料有金属纳米材料 (贵金属和过渡金属) 和非金属纳米材料 (半导体、石墨烯和量子点等) 。依据材料的组成, SERS活性基底可分为单一SERS活性基底和复合SERS活性基底。单一SERS基底是指利用一种材料制备的基底, 复合SERS基底是利用两种或两种以上材料制备的基底。
 
在诸多材料中, 以贵金属应用最多, 其中又以Au、Ag最为常见。随着纳米技术的发展, 许多不同形貌的金银纳米颗粒 (如纳米线、纳米棒、纳米片、纳米星、纳米花等) 已被报道[13,14,15,16,17]。Bian和Lu等[18,19]分别借助电沉积法和液相还原法合成了含有凹面花瓣和普通的花状银纳米粒子, 通过对罗丹明6G (R6G) 拉曼信号的检测对该SERS基底的性能进行评价, 检出限分别为10-12、10-7mol/L;验证了不同粒径形貌的纳米基底对SERS增强效应有较大影响的结论。除了传统贵金属的SERS增强效果显著外, 半导体材料在SERS活性增强方面也有巨大潜力[20,21,22]。Wang等[20]合成了非晶态和晶态的Zn O纳米笼, 以探针分子4-MBA、4-MPY和4-ATP研究此两种基底的SERS活性, 发现非晶态Zn O纳米笼的SERS增强活性强于晶态Zn O纳米笼, 前者的增强因子 (EF) 高达6.62×105, 这是首次在非晶半导体材料中观察到如此显著的SERS活性。Li等[23]以不锈钢纤维为固相载体, 用简单的水热法在其表面合成Zn O纳米棒, 再在室温下通过离子溅射将Au纳米粒子修饰到Zn O纳米棒上, 形成Au-Zn O纳米棒复合基底 (图2) , 将该SERS基底应用于结晶紫 (CV) 和孔雀石绿 (MG) 的检测, 增强因子 (EF) 分别为2.76×105和5.3×105, 检出限分别为0.103 nmol/L和0.241 nmol/L, 低于国家标准检测方法的最低检出浓度 (0.5μg/kg) 。此外, 本课题组[24]以醋酸锌和六次甲基四胺为原料通过绿色环保的水热法在氧化铟锡 (ITO) 玻璃上制备出顶端多孔Zn O纳米棒 (图3) , 目前正与其他SERS增强材料结合以开发出新型基底, 为其他研究者提供相关借鉴。
图2 在不锈钢纤维上合成Au-Zn O纳米棒的过程 (A) 及Au-Zn O纳米棒的SEM图像 (B) [23]Fig.2 Fabrication process for the Au-Zn O NRs on the stainless steel fiber (A) and SEM image of Au-Zn O NRs (B) [23]
 
 
图3 微孔Zn O纳米棒的低倍率 (A) 和高倍率 (B) SEM图[24]Fig.3 Low-magnification (A) and high-magnification (B) SEM images of microporous Zn O NRs[24]
 
 
2 SERS检测模式
2.1 SERS直接检测技术
 
SERS直接检测技术, 即无标记检测技术, 其原理是利用目标分子与金属表面结合, 使待测物靠近基底表面, 从而达到增强目标分子拉曼信号的目的。借助SERS丰富的指纹谱图性质, 可对待测目标物指纹区特征性单一谱带 (分子指纹) 进行分析, 方法具有操作简便、数据分析简单的优势。如郑华军[25]采用液相还原法合成了SERS活性较高的花状银纳米颗粒, 之后将纳米银溶胶转移到单晶硅片上, 在真空干燥的条件下得到组装在硅片上的花状纳米银SERS衬底, 将一定浓度的R6G滴于SERS衬底, 待有机试剂挥发后即可进行检测。但SERS直接检测技术也存在弊端, 如背景噪声相对略强, 对目标分析物结构及所带电荷性质有特殊要求等[26]。例如, 王珊等[27]利用SERS技术检测食用油中的苯并芘, 但由于苯并芘分子不含能与金属配位或键合的官能团, 从而增加了SERS技术对其直接检测的难度, 所以需对基底进行衍生化, 研究者们选择以纳米金修饰的氨基改性硅烷化的担体作为表面增强拉曼光谱的活性基底, 以实现食用油中苯并芘的快速检测。因此, 直接检测技术适用于体系较为简单以及能与SERS基底产生相互作用的样品检测。
图4 SERS纳米探针的制备 (A) 及竞争性SERS免疫分析方案 (B) [30]Fig.4 Preparation of SERS nanoprobes (A) and scheme of the competitive SERS immunoassay for clenbuterol (B) [30]
 
 
2.2 SERS间接检测技术
 
SERS间接检测技术, 是一种主要针对散射截面积较小的离子和小分子的检测方法, 其利用具有拉曼活性的有机分子与目标物结合后增强目标物拉曼活性以达到对目标物灵敏检测的目的[28,29], 包括标记SERS检测和SERS传感检测等。Zhu等[30]采用标记SERS检测技术, 在胶体金上标记4, 4-联吡啶 (DP) 和克伦特罗抗体制备SERS纳米探针, 以游离的克伦特罗和包被于固相载体上的克伦特罗竞争SERS纳米探针上的克伦特罗抗体后, 通过检测DP的拉曼强度间接实现克伦特罗的定量检测 (图4) 。杨涵茹[31]利用基于表面反应的SERS传感器实现了自来水中亚硝酸根离子的检测, 以IP6@Ag NPs (IP6, 稳定剂植酸钠) 作为SERS活性基底, 通过对巯基苯胺 (PATP) 与亚硝酸根离子在酸性条件下的偶氮反应, 分析反应前后偶氮苯的SERS特征峰强度变化以实现定量分析。SERS间接检测技术不仅操作简便快速、灵敏度高、适于多组分分析, 还可弥补SERS直接检测技术的不足, 实现非拉曼散射体的检测;但也存在受体制备耗时、成本高, 对基底的生物相容性要求高, 以及基底的可重复性和保存时间难控制等缺陷。
3 SERS在食品安全检测中的应用
3.1 SERS在食品有害小分子检测中的应用
 
非法添加剂、农兽药残留均为食品中常见的有害小分子物质, 一些不法商家为提高产品的产量和销量, 往往会在农业生产、畜牧业和水产养殖以及生产加工过程中添加此类有害物质, 如近年来曝光的苏丹红辣椒酱、三聚氰胺奶粉和塑化剂饮料、速生鸡等事件, 给食品安全带来了巨大威胁。因此, 快速鉴别食品中是否含有有害小分子物质对食品安全的保障具有重要意义, 而SERS技术可满足这一检测要求, 并已在有害物质的检测中得到广泛应用 (表1) 。
 
Mecker等[32]采用柠檬酸钠包覆的金纳米颗粒作为SERS的基底, 开发了一种用于现场检测三聚氰胺的方法, 在以异丙醇为提取溶剂的条件下, 可以消除基质对基体的干扰, 通过由添加异丙醇而形成的金纳米颗粒附聚物可使三聚氰胺的拉曼信号增强105, 该方法对婴儿配方奶粉、乳糖、聚维酮、乳清蛋白、麦麸和小麦面筋的检出限为100~200 mg/L。Jahn等[33]采用一种表面改性的Ag纳米颗粒作为SERS基底检测食品中的苏丹红染料, 通过在SERS基底表面组装一层亲脂分子 (含硫醇基团, 对贵金属表面有高亲和性) , 形成一疏水单层, 在进行检测时, 疏水单层吸附水不溶性分子 (苏丹红染料) , 从而克服了水环境下检测偶氮染料苏丹红的局限性。实验结果表明, 方法检出限为3.2μmol/L, 在辣椒粉中的检出限为9.0μmol/L。
 
Müller等[34]采用表面增强拉曼光谱技术检测柑橘和香蕉表皮的杀菌剂噻苯咪唑残留, 结果显示, 市场中香蕉的噻苯咪唑使用量在安全范围内, 柑橘皮样品含量则严重超标, 检出量为78 mg/kg。Furini等[35]通过优化SERS活性基底, 发现银溶胶在多菌灵的SERS检测中效果最好, 此条件下检出的浓度可达6.54×10-8mol/L。Wijaya等[36]对未经处理的苹果表皮和苹果汁中的杀虫剂啶虫脒残留进行了SERS检测, 检出量分别为2.5μg/L和3μg/L, 远低于最高限定浓度。
 
Li等[37]采用SERS标记技术的原理, 开发了一种基于表面增强拉曼散射 (SERS) 的超灵敏竞争性免疫色谱法 (ICA) , 用于检测组织和尿液中的呋喃它酮代谢物 (AMOZ) , 方法可在15 min内完成测定, 检出限低至0.28 pg/m L。Chen等[38]将直立的金纳米棒与SERS相结合测定水溶液和鱼样品中的孔雀石绿 (MG) 和结晶紫 (CV) 及其混合物, 检测结果表明, 该方法能区分水溶液和鱼样品中的MG、CV及其混合物, 且检出限均为1 mg/L。马?淼萚39]利用表面增强拉曼光谱 (SERS) 和静电富集 (EP) 相结合的技术, 实现了水环境中磺胺甲基嘧啶、丁胺卡那霉素、恩诺沙星和环丙沙星的有效富集和快速痕量检测, 4种抗生素的最低检出浓度均小于10-7mol/L。
 
表1 SERS应用于食品中其他有害小分子物质的检测Table 1 Application of SERS in the detection of other harmful small molecules in food    下载原表
 
常见的食源性致病菌有鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、大肠杆菌O157∶H7、李斯特菌以及布鲁氏菌等。这些致病菌通过污染水和食物引起人类的食源性疾病。目前, 食源性疾病被认为是发达国家和发展中国家最重要的公共卫生问题。因此, 加强食品中致病菌的检测对保障人民的食品安全具有重要意义。
 
目前, 我国传统的食源性致病菌的检测是基于微生物形态学, 但此方法存在耗时长、操作繁琐等缺点, 不适用于现场检测。Xu等[55]发现细菌细胞膜表面有大量的生化成分, 可作为菌种快速识别和鉴定的标志。该研究利用SERS对临床病人和环境中分离获得的4种基因型的7株副溶血弧菌进行了鉴定, 结果表明, 每株细菌均有区别于其他菌株的特征峰, 说明该方法在单个菌种样品和多菌种混合样品中均能得到良好的鉴定结果。Wu等[56]基于SERS标记检测的原理, 开发了一种基于适配体识别的磁性辅助表面增强拉曼光谱生物传感器, 与常规拉曼光谱检测金黄色葡萄球菌的结果 (检出限为10cells/m L) 相比, 该方法具有更高的灵敏度, 可实现金黄色葡萄球菌的单细胞检测。Wang等[57]基于万古霉素修饰改性的Fe3O4@Ag磁性纳米粒和作为二次增强粒子的等离子体激元Au@Ag纳米粒的联合使用, 研发了一种可方便检测不同致病菌的SERS生物传感器。此体系将修饰改性的Fe3O4@Ag磁性纳米粒子作为细菌捕捉工具和SERS信号放大平台, 用磁铁分离形成的磁性纳米粒子-细菌复合物, 然后将Au@Ag纳米粒扩散到复合物上, 通过Fe3O4@Ag磁性纳米粒和Au@Ag纳米粒的协同增强, 在细菌表面产生大量热点, 致使细菌的SERS信号极大增强。基于这种双重强化策略, 可保证细菌检测的重复性和灵敏度。研究结果显示, 该方法耐受的p H值范围广 (p H 3.0~11.0) , 检测时间短 (30min) , 选择性高, 检出限为5×102cells/m L。
3.3 SERS在重金属污染检测中的应用
 
随着水体和土壤污染问题的日益严重, 由重金属导致的食品安全问题引发越来越多的关注。重金属离子通过食物链累积并贮存在生物体内, 当被人体吸收后, 可通过与人体内蛋白质结合使其失活的方式严重影响人们的生命安全。
 
Eshkeiti等[58]在硅晶片上印刷粒径为140 nm的Ag纳米粒子作为一种新型SERS基底, 并用于有害重金属的检测, 通过比较有毒重金属Hg S、Cd S和Zn O在新型SERS基底和硅晶片上的拉曼信号强度, 发现新型SERS基底在增强重金属拉曼强度方面具有很大优势, 适用于样品中有毒重金属的检测。Zhao等[59]在石墨烯纳米片上合成金纳米粒子, 以石墨烯为拉曼探针分子检测水样中的Pb2+, 方法检出限为1 nmol/L, 线性范围为5 nmol/L~4μmol/L。Yang等[60]开发了一种以Co Fe2O4@Ag纳米颗粒为磁性基底的表面增强拉曼光谱传感器, 主要由巯基修饰的单链DNA (SSDNA) 、单壁碳纳米管 (SWCNT) 及Co Fe2O4@Ag纳米颗粒3部分组成;单壁碳纳米管作为拉曼探针, 在Co Fe2O4@Ag纳米颗粒为基底的情况下有很强的拉曼信号峰。该传感器的主要检测原理为:巯基修饰的单链DNA通过Ag—S键结合在磁性基底Co Fe2O4@Ag上后, 单链DNA和单壁碳纳米管通过碱基和碳纳米管之间的π-π堆积连接, 最终得到一个螺旋缠绕的结构。当Hg2+存在时, 单链DNA捕获Hg2+形成胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶 (T-Hg2+-T) 碱基对, 同时会使单壁碳纳米管解离出来, 导致拉曼信号减弱, 传感器上单壁碳纳米管的拉曼信号随着Hg2+含量的增加而减少, 可实现Hg2+的定量检测, 该方法的检出限为0.84 pmol/L, SERS峰强度与汞离子浓度在1 pmol/L~100 nmol/L呈良好的线性关系。
3.4 SERS在真菌毒素检测中的应用
 
真菌毒素是由产毒真菌产生的次级代谢产物, 具有极强的毒性和致癌、致畸、致突变作用, 是世界各地的农产品和食品的主要污染物之一, 主要包括黄曲霉毒素、展青霉素、伏马菌素、赭曲霉毒素A等。真菌毒素会通过被污染的谷物、饲料和由这些饲料喂养的动物性食品进入食物链, 对人畜的健康造成极大威胁。因此建立快速高效、经济灵敏的检测方法已成为当前的研究重点。
 
李琴[61]构建了基于适配体识别和磁分离辅助的用于快速检测黄曲霉毒素B1 (AFB1) 的SERS传感器, 通过磁珠组装构建的检测探针和SERS标记探针共同竞争AFB1, 根据标记探针SERS强度的变化达到快速检测AFB1的目的, 该传感器的检出限为0.4 pg/m L。Lee等[62,63]使用有效的银枝晶对磨碎玉米样品中的伏马菌素进行分类和定量分析, 发现其灵敏度和特异性均优于常规拉曼检测技术。
4 总结与展望
 
作为一种新兴的快速检测方法, 表面增强拉曼光谱技术因可以提供物质的指纹图谱和低成本、高灵敏度、操作简单、对样品检测无损且不受水干扰等优点, 成为食品安全检测领域近几年的研究热点。然而, SERS技术的发展与应用仍存在许多问题亟待解决: (1) 对SERS机制的本质认识不充分, 相比实验和应用所取得的进展, SERS理论研究相对滞后; (2) 目前常用的SERS基底材料为贵金属或贵金属和其它材料的复合物, 基底成本较高; (3) 因SERS基底重现性和稳定性较差, 使得SERS技术的应用难以广泛商业化和标准化, 利用SERS技术进行食品安全快速检测的市场推广较难大范围进行; (4) 目前SERS技术仅对食品中某些有害物质进行了检测和鉴定, 尚无建立食品中多种违禁物的“拉曼光谱指纹”数据库, 对于未建立指纹图谱的物质较难检测。
 
SERS技术在食品安全检测方面的发展趋势主要包括对表面增强拉曼光谱机制的进一步探索以及食品中有害物质SERS谱图库的建立?梢栽ぜ, 未来通过对SERS机理的深入认识, 可合成排列更规则、尺寸更均一、重现性更好、灵敏度更高、成本更合理的SERS活性基底, 从而解决SERS技术应用于食品安全快速检测重现性差、稳定性差和成本高的问题。通过广泛的收集和汇总食品中多种有害物质的SERS谱图, 建立可搜索、可操作的数据库和网络平台, 不仅可跨越时间和地区的界限, 实现多研究机构资源共享, 还能满足食品安全检测中现场快速准确检测的需求, 实现SERS技术更大范围的市场推广。
 
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