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拉曼光谱技术在医学诊断中的研究进展

1928年, 印度科学家Raman发现了拉曼散射效应[1], 即一定频率的激光照射到样品表面时, 物质中的分子吸收了部分能量后发生不同方式和程度的振动, 然后散射出较低频率的光。频率的变化取决于散射物质的特性, 不同原子团振动的方式是唯一的, 因此, 可以产生特定频率的散射光, 其光谱就称为“指纹光谱”。近几十年里, 拉曼光谱已广泛应用于多个领域[2,3], 其在医学诊断中的价值也日益提高。

细胞或组织中可能引起疾病的生物化学变化可导致拉曼光谱的显著改变。拉曼光谱仪可以在分子水平检测这种生物化学变化, 从而实现疾病诊断。它具有高特异度、高分析效率及对各种复杂样品 (如各种体液、组织) 无需染色或标记等特征, 与其他成熟的医学成像技术 (如超声、磁共振成像等) 相比, 拉曼光谱能以相对低的成本提供实时分子信息和高分辨率成像, 故成为诊断疾病、预后评价或新疗法的工具。

1 用于医学诊断的拉曼光谱技术

1.1 显微拉曼光谱技术

显微拉曼光谱技术是将拉曼光谱分析技术与显微分析技术联合应用, 采用了低功率激光器、高转换效率的全息电荷耦合阵列检测器[4]以及共焦技术。与传统拉曼光谱技术相比, 它有灵敏度高、测量时间短、所需样本量小等优点, 因此被广泛应用于肿瘤的诊断[5,6]。

1.2 表面增强拉曼光谱 (surface enhanced Raman spectroscopy, SERS) 技术

当一些分子被吸附到某些粗糙的金属 (如银、铜、金等) 表面上时, 它们的拉曼散射强度会增加104~106倍, 即SERS。它克服了传统拉曼信号灵敏度低的弱点, 从而获得常规拉曼光谱难以捕捉到的信息, 是拉曼光谱研究中一个活跃的领域[7,8]。近几年, SERS技术以其特有的精细分辨能力、高分析效率、高度自动化、信息丰富、所需样品量少等优点, 在肿瘤、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病的诊断方面均取得了突破性的研究进展。

1.3 傅里叶变换拉曼光谱 (Fourier transform Ra-man spectroscopy, FT-Raman) 技术

影响拉曼光谱灵敏度的一个很大干扰因素是荧光现象, 而FT-Raman很好地弥补了这一缺陷, 同时它还具有精确度高、测量频率范围广、热效应小等特点, 在肿瘤组织检测、牙齿结构分析、骨质量评价[9,10,11]等方面有诸多应用价值, 在协助或确定疾病诊断中发挥了重要作用。

1.4 空间位移拉曼光谱 (spatially offset Raman spec-troscopy, SORS) 技术

传统的拉曼光谱只能探测样品的浅表信息, 或者只能穿透透明的表层来探测底层。而新型的SORS技术在激光斑点和横向偏移的位点处收集散射光子, 可以深入探测样品若干毫米, 以分析不透明样品内部的化学信息。SORS不但具有拉曼光谱的化学专属性, 而且能提供样品深层的信息, 其诊疗价值体现在泌尿系统、骨、乳房等疾病中的应用[12,13,14]。

1.5 相干反斯托克斯拉曼散射 (coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS) 技术

CARS通常采用两个脉冲激光器, 即频率为ωp的泵浦光束和与样品相互作用的频率为ωs的斯托克斯光束。当能量差ωps与样品的分子振动匹配时, 在频率ωas=2ωps处产生谐振增强的CARS信号。CARS主要通过激发脂质和蛋白质中的碳氢键的伸缩振动来对细胞和组织成像, 与普通拉曼光谱相比, CARS具有高能量转换效率、曝光时间短及对生物样品损伤小等优点, 已成功地用于识别切除的肿瘤。

1.6 光纤拉曼探针

拉曼光谱与光纤探针的有效结合, 使其成为空腔脏器疾病的一种潜在的理想的诊断工具。用于活体检测的拉曼探针需克服信噪比弱、光纤本身产生拉曼信号及光致发光等问题。尽管如此, 其在医学领域中的应用仍越来越广泛。将拉曼探针与内镜技术相结合, 通过其提供的实时生物信息, 对诸如胃癌、膀胱癌等肿瘤的早期诊断有重要价值。

2 拉曼光谱技术在疾病诊断中的应用

2.1 以组织器官为检测对象

2.1.1 脑组织

目前通过对人或动物脑组织行拉曼光谱检测研究阿尔兹海默症[15,16]、帕金森病[17]及各种脑肿瘤[18,19]的报道屡见不鲜。随着技术的不断发展, 科学家逐步尝试将其应用于脑疾病的在体、实时检测, 为临床诊治创造条件。

许多脑肿瘤目前主要是通过CT扫描、磁共振成像及脑电图等检查初步诊断, 再经术后病理学检查确诊。术中须准确区分肿瘤组织与正常组织, 以避免损伤功能性脑结构, 同时降低因肿瘤切除不完全而复发的风险。Tanahashi等[20]对血小板衍生生长因子B诱导的浸润性胶质瘤小鼠进行肿瘤细胞及组织的拉曼测量, 并与正常小鼠的星形胶质细胞及脑组织拉曼进行对比, 得到归属于苯丙氨酸、脂质、DNA和蛋白质的胶质瘤特征性拉曼谱峰。其区分胶质瘤细胞的灵敏度和特异性分别为98.3%和75.0%, 组织样本诊断胶质瘤的灵敏度和特异性分别为58.8%和76.4%。Kirsch等[21]通过将小鼠黑素瘤细胞注射到小鼠的颈动脉中诱导转移性脑肿瘤, 并采用光纤拉曼探针技术成功实现对脑肿瘤的在体拉曼测量, 基于光谱信息, 使得对大脑皮层和皮层下肿瘤细胞团块的定位能够精确到大约250μm。上述研究都证实了拉曼光谱用于组织表征的能力及用作脑部疾病在体诊断、治疗工具的潜力。脑作为人体最复杂及敏感的器官之一, 决定了用于其疾病的诊疗工具需要具有更高分辨率, 更短收集时间和更高精确度, 这也是拉曼光谱技术今后需要不断优化的方向。

2.1.2 骨组织

拉曼光谱因具有识别骨组织中细微分子变化的能力, 已用于骨关节炎、骨质疏松等疾病的早期诊断以及骨折风险的评估。骨拉曼光谱可用于评估与骨质量相关的骨组成参数, 例如矿物质与基质的比例, 碳酸盐与磷酸盐的比例, 矿物结晶度和 (或) 胶原的成熟度。与传统检查手段如双能X线、定量CT、核磁共振等相比, 拉曼光谱能够更早发现骨密度、骨结构的改变。Mccreadie等[22]对发生过骨质疏松性骨折妇女的股骨及髂嵴组织标本进行拉曼检测, 获得小梁骨及皮质骨的化学组成信息, 并与正常妇女作对比, 结果发现骨折妇女的骨组织光谱具有更高的碳酸盐/酰胺Ⅰ值及碳酸盐/磷酸盐值。因此, 可以将拉曼光谱所反映的骨组织的化学成分用于骨质疏松性骨折的风险评估。

近年来, 已报道了用于动物的在体骨拉曼光谱检测[23], 但因其侵入性等原因尚未应用于人体。Towler等[24]提出, 将指甲拉曼光谱作为一种间接评估骨质量的方法, 人类指甲中的角蛋白和骨胶原蛋白的结构完整性均需要硫酸化和二硫键形成来实现, 研究结果显示, 与健康人相比, 骨质疏松患者指甲二硫化物含量显著降低, 提示可以通过转换检测对象来实现拉曼光谱对疾病的诊断。

2.1.3 心血管

冠状动脉粥样硬化斑块破裂形成血栓是引起急性冠脉综合征的主要原因, 亦是冠心病致死的重要原因。动脉粥样硬化斑块的稳定性及破裂风险很大程度上取决于其化学成分和超微结构[25]。拉曼光谱可对斑块组成成分如胆固醇、胶原纤维、磷酯、钙盐沉积等进行定位及定量检测, 且与血管内超声等传统方法相比, 其识别性更高, 对组织无破坏性, 对及早发现不稳定斑块有独特的优越性[26]。Nogueira等[27]应用FT-Raman对75个颈动脉样品进行检测, 并将拉曼结果与组织病理学结果进行比较, 通过主成分分析及判别分析发现, 拉曼光谱可有效地区分非动脉粥样硬化组织、无钙化的脉粥样硬化斑块和钙化斑。其对非动脉粥样硬化组织的敏感性和特异性分别为96%和93%。非钙化斑块和钙化斑块诊断的敏感性分别为89%和96%, 两者的特异性为100%。目前, 拉曼光谱对动脉粥样硬化斑块的检测实验均为离体条件下的结果, 但随着介入技术及光纤探头的改进和成熟, 在体血管内斑块的迅速、准确检测终将成为可能, 这对冠心病急性事件的预防具有重大意义。

2.1.4 眼

拉曼光谱在眼科领域的应用主要集中在对角膜、晶状体及视网膜的检测。Bauer等[28]采用聚焦拉曼光谱技术首次成功获得了人角膜组织的拉曼光谱图。Ammar等[29]应用CARS进行了角膜拉曼检测, 认为该技术通过分析角膜的细胞数量及类型, 可应用于多种眼科疾病诊治, 如明确角膜炎病因 (细菌性、真菌性、病毒性等) 及损伤程度, 更好地指导临床用药。也可用于角膜手术后观察伤口愈合部位的细胞数量和代谢状态。近年来, 拉曼光谱在青光眼、白内障、翼状胬肉等疾病中的研究也有报道, 但多为离体或动物实验结果, 由于眼特有的光学特性及解剖特点, 使得对活体原位拉曼检测技术的要求较其他部位更高, 需严格控制激光能量及扫描时间以确保安全。随着更多眼部组织的拉曼光谱特征信号的提取, 其为眼科疾病的发病机制研究及临床诊治提供了新的线索, 因此拉曼光谱在眼科领域拥有着广泛的应用前景。

2.2 以生物流体为检测对象

2.2.1 血液

血液内含有蛋白质、脂类、核酸、无机盐、糖、维生素等各种成分, 疾病的发生以及药物的疗效与这些分子的构象、组成和相互作用有着十分密切的联系。拉曼光谱可反映这些分子变化继而实现对疾病的诊断。周涵婧[30]对比分析了胃癌患者和正常人血液的SERS光谱发现, 胃癌患者血清光谱中归属于核酸的拉曼峰均较高, 归属于蛋白质的峰较低, 经主成分分析-线性判别分析验证, 其灵敏度为88.5%, 特异度为90.0%。血清拉曼光谱同样应用于鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌及宫颈癌等[31,32]肿瘤的研究, 通过血液成分变化可更早实现癌症诊断。

韩洪文等[33]将糖尿病及其并发症患者的血清与正常人血清拉曼光谱进行对比发现, 前者谱线725 cm-1, 相对强度明显增强, 且增强部分来自腺嘌呤的贡献, 它与血糖水平无关, 为研究糖尿病及其并发症的生化机制和临床诊断提供了新的实验依据。

Sahu等[34]对44名严重程度不等的哮喘患者及15名正常人进行血液拉曼检测, 发现两者间存在显著差异, 而且光谱中蛋白质结构的变化、DNA特异性谱带的增宽及黏多糖特征峰的增强均随哮喘严重程度的增加而更显著。Hobro等[35]对疟疾患者血液进行拉曼光谱检测, 通过血红蛋白、血红素等的光谱变化, 可以在疟原虫感染早期明确诊断, 比血涂片镜检更敏感。综上所述, 血液拉曼光谱已应用于多种疾病检测, 而且其生物成分变化较组织更早、更敏感, 同时血液标本具有易获得、创伤小、可重复取样等优点, 在疾病筛查、诊断及病情监测中极具优越性。

2.2.2 唾液

姚雨露等[36]收集了吸毒者 (44例) 、艾滋病患者 (45例) 、肺癌患者 (11例) 、乳腺癌患者 (11例) 及健康对照组 (55例) 的唾液标本进行拉曼光谱检测, 统计分析结果显示, 通过唾液的拉曼光谱检测可有效区分以上患者与正常人。同样的结果也在肺癌、肝癌等[37,38]疾病的研究中得到证实。与血液样本相比, 唾液采集更安全、更方便, 且为无创性, 可能更适合大规模普查疾病。

2.2.3 尿液

尿液拉曼光谱检测同样以其标本易获取、无创等优点, 被广泛用于膀胱癌、前列腺癌等疾病的研究[39]。同时, 尿中各种物质如蛋白、葡萄糖、肌酐等成分的变化可反映物质代谢状态及肾功能水平, 提示其拉曼光谱检测可能在全身代谢性疾病诊治及肾功能监测等方面具有广阔的发展前景。

3 展望

拉曼光谱技术所具有的非破坏性、无放射性、高分辨力、高度自动化等优点, 使其在医学领域的应用方兴未艾, 但要真正成为一种临床常规诊断工具仍面临着巨大的挑战。这有赖于更多的基础及临床研究来提供坚实的理论依据及安全保障;有赖于仪器及技术本身的发展来实现更加实时、安全、有效的测量;有赖于统计模型的优化来实现数据快速分析以协助诊疗。从近几年的研究进展来看, 拉曼光谱技术已在医学诊断方面取得了突破性的研究进展, 包括了神经系统、循环系统、泌尿生殖系统等全身各系统疾病。且随着各种适合医用的拉曼探针及拉曼光谱仪的问世, 其对体表组织 (如皮肤、乳腺) 和体内脏器 (如胃肠道、膀胱) 的实时、在体检测也已取得部分成功。综上所述, 拉曼光谱技术在医学领域具有广阔的应用前景, 其应用重点终将从实验研究转向临床常规诊疗。

参考文献


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