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拉曼光谱技术在肉品质评价中的应用

 
 
随着人们生活水平的提高, 消费者对高品质畜产品的需求不断增加, 导致市场消费结构发生改变, 尤其是味道鲜美、营养丰富以及富含高蛋白质的肉类食品在人们膳食结构组成中占据很大比例。在利益驱动下, 畜牧生产中存在一些肉品掺假现象, 伴随着消费者对食品的安全意识不断增强, 畜产品的安全生产和质量保障正面临着巨大的挑战。因此, 准确、快速、高效的质量检测以及安全评定技术体系的建立对畜牧业的健康发展有着十分重要的意义。
 
目前, 我国对肉品质的评价方法主要以理化分析为主, 辅以人工感官评定, 这些传统方法普遍存在着结果一致性较差、分析时间长、成本高、效率低、需要对不同测定样品做不同处理等缺点, 不能满足企业和市场的需要, 无法顺应现代畜牧业的快速发展趋势[1]。但是拉曼光谱凭借其操作简单、易于实现在线分析、分析效率高、样品无需处理以及不受水介质干扰的特点, 成为了一种快速无损的新型检测技术。本文从拉曼光谱仪技术的原理出发, 结合近红外光谱技术在肉品质评价领域中的应用, 综述该技术在肉品质感官评价、在线检测以及安全评价中的应用。
1 拉曼光谱技术的原理及发展介绍
 
拉曼光谱技术的建立基于拉曼散射效应。Smekal等[2]首次提出光的非弹性散射理论——光通过某一介质时, 散射出光的频率会由于两者的相互作用发生变化, 进而导致相位也出现随机改变。Raman及其团队于1928年首次观察到光的非弹性散射现象, 从实验上证实了Smekal理论的正确性[3]。
 
当用一束单色光 (激光) 照射样品时, 入射光子与样品分子发生相互作用, 样品分子吸收光子的能量, 由基态跃迁到虚态, 随后因为虚态的不稳定回到基态, 释放出光子。若分子回到原始基态, 则说明光子和样品分子之间没有发生能量交换, 仅传播方向发生改变, 这种现象称作瑞利 (Rayleigh) 散射, 为弹性散射。若样品分子回到较原始基态高的基态, 则说明光子在碰撞过程中将部分能量传递给分子, 导致出射光的频率小于入射光, 这种现象称作斯托克斯 (Stokes) 散射。若分子回到较原始基态低的基态, 则说明样品分子在碰撞过程中将部分能量传递给光子, 导致出射光的频率大于入射光, 这种现象称作反斯托克斯 (Anti-Stokes) 散射。在斯托克斯和反斯托克斯散射现象中, 光子和样品分子发生了能量交换, 导致出射光频率发生改变, 这两种散射统称为拉曼散射, 为非弹性散射。由于斯托克斯拉曼散射光的强度总是大于反斯托克斯光的强度, 所以通常所说的拉曼散射都是指斯托克斯散射。
 
样品分子处于不断运动的状态, 分子运动的能量包括平动能、电子能、振动能和转动能。平动能是连续变化的, 电子能、振动能和转动能均是量子化的, 通常将分子量子化的能量状态称作能级, 而且只有分子的振动、转动能级具有拉曼活性[4]。分子结构的特异性决定每一种样品的振动、转动模式各不相同, 所以拉曼谱线的数目、位移值大小和谱带强度都具有特异性。样品分子的每一个化学键和官能团都有特定对应的振动和转动能, 反映在拉曼图谱的拉曼频率和拉曼峰强。从特征拉曼频率可以确定分子中的官能团和化学键的存在, 进行定性分析;从拉曼峰强可以确定官能团和化学键的含量, 进行定量分析;并且根据拉曼频移的大小和方向可以判定官能团和化学键所处化学环境的变化[5]。
 
随着光谱激光技术和信息处理技术的不断发展和改进, 拉曼光谱的分辨率和灵敏度也随之不断提高, 并且发展出了多种拉曼光谱分析技术, 如傅里叶变换拉曼光谱分析技术、激光共振拉曼光谱分析技术、共焦显微拉曼光谱分析技术、表面增强拉曼光谱分析技术、高温拉曼光谱分析技术等。各种拉曼光谱技术原理类似, 各具特点, 优势互补, 使得拉曼光谱技术的发展潜力不断提升, 应用领域不断扩大[6]。
 
拉曼光谱是一种新型的快速检测技术, 在我国畜牧行业中的应用还处于起步阶段, 而可见-近红外技术在肉品质的检测中已得到广泛地应用。近红外光是介于可见光区与中红外区之间的电磁波, 波长范围在700~2 500 nm。红外光谱反映的是分子内部的偶极矩的改变, 主要是由C-H、O-H、N-H、S-H等含氢极性集团振动引起的。由于大多数有机物都含有不同的含氢基团, 所以近红外光谱技术在水分、蛋白质、脂肪、脂肪酸组成以及矿物质等肉品化学成分的检测方面取得不少研究成果[7,8,9,10]。研究发现, 利用近红外反射光谱可以准确测定肉中主要成分的含量, 但是该技术往往需要将肉样制备成肉糜状, 并且样品的制备以及装样不合理往往会导致预测结果出现较大误差。同样, 光谱技术能够很好地对肉类掺假进行快速检测, 并且利用近红外光谱技术可以有效地评价肉新鲜度, 但是往往会受到单点检测以及其他因素的影响, 使得利用近红外光谱技术对肉品质的全面评价受到限制[11]。不过苏华维等[12]综述发现, 国产近红外光谱仪器可以用来预测牛肉中脂肪、蛋白和水分的含量, 基本可以替代传统化学分析方法用于牛肉化学成分的检测。但是, 使用国产近红外光谱仪器建立的牛肉p H、剪切力、蒸煮损失和颜色值 (L*、a*、b*) 的NIRS预测模型精度一般, 目前条件难以替代传统检测方法。
 
与可见-近红外光谱相比, 拉曼光谱反映的是物质中化学基团在原子振动下发生的可极化性的改变, 这种改变是由非极性基团振动引起的, 例如C-C、C=C、N=N、S-S等, 这些基团在振动时偶极矩不会发生变化。所以, 拉曼光谱通常用于检测含有非极性基团的物质, 在样品分子的结构分析应用上, 拉曼光谱和红外光谱互相补充。此外, 由于水的极性特征, 其红外吸收很强而拉曼散射却很弱, 因此水对红外光谱的影响较大而对拉曼光谱的影响很小[13]。因此, 拉曼光谱技术在水溶液体系检测中具有十分显著的优势, 在测定前不需要进行冻干粉碎或快速干燥等处理。更重要的是, 拉曼光谱技术能够很好地反映蛋白质的二级结构, 如α-螺旋和β-折叠, 能够为氨基酸残基的研究提供很好的线索[14]。拉曼光谱技术所测样品数量很少, 并且仪器成本较低, 操作更简单。同样, 拉曼光谱的谱峰比较尖锐, 很少发生重叠现象, 能够较好地分辨振动频率, 利于对拉曼光谱进行处理分析[15]。因此, 拉曼光谱在肉品质感官评价指标预测方面有着巨大的应用潜力。
2 拉曼光谱技术在肉品质评价中的应用
2.1 在肉品质感官评价中的应用
 
消费者评价肉品质好坏主要依靠其对肉的外表观察以及感官评价。消费者能够直观地观察肉的肉色和大理石花纹, 但是却难以评价肉的嫩度、咀嚼性和多汁性。
 
肉的嫩度是消费者最重视的食用品质之一, 指肉在咀嚼或切割时所需的剪切力, 表明熟肉在入口后被咀嚼时柔软、多汁和易嚼烂的程度, 根据肉在食用时口感的老嫩反映肉的品质。Beattie等[16]在前人关于肌球蛋白的拉曼光谱特征和蛋白质拉曼光谱谱带的指认的研究基础上, 首次提出利用拉曼光谱技术对肉品质进行感官评价。研究团队利用PLRS数据分析方法处理光谱数据, 对52份熟制牛肉进行原位检测。研究发现, 1 460~1 483/cm (-CH2和-CH3弯曲振动) 区域谱带能够反映肉品质的多汁性, 说明脂肪族氨基酸残基间的疏水相互作用是影响肉品质评价中的多汁性指标的重要因素。同时发现, 酰胺Ⅰ (1 669/cm) 和酰胺Ⅲ (1 235/cm) 两处谱带强度增加与β-折叠含量的增加有关, 说明牛肉中蛋白质中α-螺旋和β-折叠的比例同样能够影响多汁性。此外, 881/cm处谱带和855/cm处谱带反映出口感硬的肉中色氨酸处于高度疏水的环境, 并且酪氨酸和氢键结合的方式更为复杂[16]。并且Beattie等[17]继续利用拉曼光谱技术测定猪背部最长肌生鲜肉样的剪切力, 结果显示相关系数为0.77。以上结果表明了拉曼光谱对蛋白质二级结构的检测数据与多汁性、嫩度等感官评价指标具有良好的相关性, 提出了拉曼光谱技术依靠其快速、无损的特点在肉品质检测中的应用具有十分巨大的潜力[17]。随后, 在Beattie等的研究基础上, Schimidt等[18]将拉曼光谱入射波长由785 nm改为671 nm, 并且使用便携式手持拉曼检测仪器, 首次对140份冷冻后绵羊腰部最长肌与背部最长肌预测其剪切力和蒸煮损失, 并利用PLSR分析方法对数据进行分析, 建立了剪切力和蒸煮损失与拉曼光谱数据之间的联系, 结果表明其具有良好的相关性, 并且研究发现, 剪切力大 (27 N/cm2) 的拉曼光谱中α-螺旋构象含量较高, 色氨酸谱带强度较大, 520/cm (S-S伸缩振动) 区域谱带中胱氨酸基团的拉曼光谱信号强度较明显[18]。
 
肉的系水力是指肌肉受外力作用 (加压、加热或者冷冻等加工贮藏方法) 时, 保持其原有水分与添加水分的能力, 滴水损失和蒸煮损失都可用来衡量这一指标。水是牛肉中营养物质的载体, 同时也是肌肉纤维细胞的重要组成成分, 是肉品质评价的另一重要指标。系水力不仅影响肉的组织结构和肉色等, 还决定了肉的风味、多汁性、嫩度和营养成分等指标。与传统系水力测定方法相比较, 拉曼光谱技术虽不能准确测定系水力, 但是能够进行快速预测分析。Beattie等[17]利用拉曼光谱技术测定熟制加工过程对猪背部最长肌的蒸煮损失的影响, 发现拉曼光谱能够很好地反映出肌原纤维蛋白的构象以及微环境的改变。熟制肉样中β-折叠和无规则卷曲含量增加, 伴随着α-螺旋含量的减少。1 445~1 500/cm区域谱带反映出疏水性与蒸煮损失存在正相关关系, 说明β-折叠构象较α-螺旋构象疏水性更强, 会导致肌肉组织中水和离子的流失。同时, 830~860/cm区域谱带 (酪氨酸) 反映出氢键数量减少导致蒸煮损失提高, 说明β-折叠构象含量与酪氨酸中氢键的数量是影响蒸煮损失的重要因素[16]。
2.2 在肉品质在线检测中的应
 
目前, 大多数利用拉曼光谱技术研究肉品质感官评价的试验主要针对冷冻、解冻肉样或者烹制好的熟肉, 并且研究基本在实验室内进行测定。为更好地将拉曼光谱技术应用到实际生产中, 部分肉品质在线检测试验已经陆续开展。Fowler等[19,20]利用与Schimidt等[18]研究中所采用的相同的便携式拉曼光谱设备对屠宰后羊肉腰部最长肌和半膜肌的剪切力进行预测, 提出了拉曼光谱技术在预测生鲜肉的剪切力方面具有应用潜力。Nache等[21]利用拉曼光谱技术对猪肉半膜肌中乳酸盐含量和p H进行现场检测, 结果良好。Scheier等[22]首次利用便携式手持拉曼光谱检测仪器在屠宰现场对完整胴体中的p H和滴水损失进行快速检测, 通过利用便携式手持拉曼光谱检测仪器在现场检测屠宰后猪肉半膜肌中磷酸肌酸、肌酸、三磷酸腺苷、肌苷酸、糖原、乳酸盐、磷酸化代谢物和无机磷酸盐的光谱信号信号, 预测p H45min和p H24h、肉色 (L*、a*、b*) 、滴水损失以及24 h和72 h的剪切力等肉品质评价重要指标, 建立了拉曼光谱数据与肉品质评价指标之间的联系, 结果表明两者间具有良好的相关性。Bauer等[23]利用拉曼光谱技术评价牛臀部位排酸冷鲜肉的嫩度, 发现检测样本重复数的增加能够显著提升拉曼光谱建模的准确性, 提高预测准确度, 并且拉曼光谱显示口感硬的肉中蛋白结构更为紧密。
2.3 在肉制品安全评价中的应用
 
肉制品安全性评价主要集中在肉品质新鲜度和掺假两个方面。新鲜度的变化主要是由微生物引起的。贮藏条件差等因素使得微生物在肉表面生长繁殖, 在微生物及内外源酶的作用下, 肉中蛋白质、脂肪被分解成小分子代谢物, 产生不良气味, 肉的p H也随之升高, 颜色也发生变化, 从而导致肉腐败变质。Argyri等[24]初次将拉曼光谱技术运用到肉品质腐败检测中, 能够准确有效快速地鉴别牛肉馅是否变质。Meisel等[25]利用拉曼光谱技术结合化学计量学方法能够准确监测肉中微生物种类。肉类食品营养丰富, 尤其是水分含量较高, 导致肉类食品在加工过程中的各个环节, 甚至是在5℃贮藏时容易发生变质。Timinis等[2[26]研究发现, 利用拉曼光谱技术可以准确预测猪肉的冷藏时间, 并判断其是否变质。肉制品在加工贮藏过程中容易被大肠杆菌、沙门氏菌等致病微生物污染, 加热不足易引起食源性疾病, 而加热过度会影响最终产品的营养和食用品质。因此, 有效地检测加热终点温度 (Endpoint Temperature, EPT) 成为控制肉制品安全和质量的必要手段。Berhe等[27]研究发现, 拉曼光谱技术能够很好地应用在EPT检测中, 并且准确度不受贮藏时间的影响。
 
全球范围内肉制品的产量和消费量不断升高, 伴随而来的是肉制品掺假事件的频繁发生。为了保护消费者的利益, 各国都已经颁布相关法规进行市场监控, 但是要保证法规的有效施行, 还需要借助科学的检测方法。Boyaci等[28]利用拉曼光谱技术结合PCA分析方法, 能够快速辨别132种脱脂肉样及其香肠制品的肉类品种, 并且检测时间短, 检测准确度高。Biasio等[29]利用激光拉曼光谱技术鉴别鸡肉、猪肉、火鸡肉、羊肉、牛肉以及马肉, 结果显示激光拉曼光谱技术在鉴别红肉和白肉种类具有良好的应用, 但是具体到化学组成方面的检测还需进一步研究。同样, Zhao等[30]研究发现, 利用拉曼光谱技术能够快速检测汉堡中所使用的牛肉馅是否掺杂牛杂碎。
3 前景展望
 
目前, 拉曼光谱技术在肉品质评价领域起步较晚, 拉曼光谱仪器运行费用十分昂贵, 一时难以在畜牧行业进行普及。并且, 由于拉曼信号本身十分微弱, 样品中有机分子吸收光子转化为荧光分子产生的荧光效应是影响拉曼光谱分析的重要因素之一, 所以激光技术、荧光背景扣除技术、信号处理技术等研究的深入及发展可以大大提高拉曼光谱的分辨率和灵敏度, 拓宽拉曼光谱技术的研究范围, 增强拉曼光谱技术的适用性。同样, 低成本和在线检测设备的开发同样能够提高拉曼光谱技术在实际生产中的利用率以及在线检测肉品质的效率。拉曼光谱技术必将凭借其快速无损等特点在肉品质评价领域中得到推广, 推动畜牧业朝着快速健康的方向发展。
 
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