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薄层色谱及其在药用植物研究中的应用

 
 
薄层色谱 (TLC) 自1938年发明以来, 自身的理论和技术得到了长足的发展, 其应用范围极其广泛, 成为现代实验室不可或缺的一种技术手段。薄层色谱法是在一定尺寸的表面平整的玻璃、铝板或塑料板上, 把硅胶、纤维素、氧化铝、聚酰胺或化学键合硅胶等吸附剂铺成薄层 (通常厚度为0.10~0.25 mm) 作为固定相, 用展开剂 (流动相) 把被测样品展开, 从而进行色谱分离和分析的方法[1]。薄层色谱仪具有能够提供图像用以直接观测并传达色谱结果, 速度快, 灵敏度高, 溶剂消耗量少, 制备量大, 成本低, 操作方便简单等优点[2,3]。薄层色谱在药用植物研究中的应用主要有药用植物活性成分提取分离及含量测定, 中药材品种真伪鉴定及其代用品寻找, 探索柱色谱分离条件, 精制和制备纯品的药物等。常用的薄层色谱法有薄层扫描法 (TLC Scanning method) 、高效薄层色谱 (HPLC) 、制备薄层色谱 (PLC) 、反相薄层色谱 (RP-TLC) 、微乳薄层色谱 (METLC) 、加压薄层色谱 (OPLC) 、离心薄层色谱 (RPC) 以及薄层色谱联用技术 (TLC-coupling techniques) 。笔者对薄层色谱方法、薄层色谱检测技术和薄层色谱在药用植物中的应用研究进展进行了综述。
1 薄层扫描法
 
薄层扫描法是把被测样品经薄层板分离后, 用薄层扫描仪在样品特定吸收波长处扫描, 利用仪器测量透过斑点或被斑点反射的光束强度的变化来进行定量分析, 是一种高效、方便、精确地定量测定样品成分含量的方法[4]。需要根据薄层斑点的面积积分, 利用回归方程来算出样品各成分含量。其定量的原理是依据Kubelka-Munk方程式:
 
(1-R) 2/2R=2.303ε (C/S) (1)
 
式中, R为薄层板表面反射的光;ε为物质的分子消光 (吸收) 常数;C为斑点浓度;S为薄层板散射常数。
 
该方程当浓度到达一定程度时是非线性方程, 而且与薄层板的性质有关, 需经过一定的数学处理来求得其反函数, 瑞士CAMAG公司就是利用这个方法进行测定。日本岛津生产的CS系列薄层色谱扫描仪在光密度计内装有线性化器, 对曲线进行校正, 使Kubelka-Munk曲线中的非线性数据线性化。为了达到分析的准确度、精确度和灵敏度, 绝大多数定量薄层色谱分析都使用高效薄层色谱分离。利用薄层色谱扫描法具有以下优势:有很高的分离选择性, 因为可以选择不同的流动相和固定相, 可以选择强制展开、梯度展开及一维、二维和多维薄层色谱;效率高;检测非常方便、廉价;可反复用不同的方法扫描;对制样要求不高。但用薄层色谱扫描法进行定量分析, 其准确性和重现性与高效薄层色谱法有一定的差距, 故可能逐步被高效薄层色谱法所取代。
 
邓双运用薄层色谱新型内标法测定了黄芩及含黄芩的中成药中有效成分黄芩苷的含量[5]。戚爱棣等通过双波长薄层扫描法测定了提取液中姜黄素的含量[6]。沈宁研究了基于数字图像原理的薄层扫描色谱技术在南五味子中五味子甲素含量测定中的应用, 证明基于数字图像原理的薄层扫描色谱技术定量分析方法是一种简便快速、经济可靠的分析方法[7]。
2 高效薄层色谱法
 
高效薄层色谱诞生于20世纪70年代, 目前已经成为平面色谱 (Planar chromatography) 里最重要的一种。高效薄层色谱的分离能力比薄层色谱法高得多, 因为薄层色谱过程中的分辨率与吸附剂半径的平方成反比, 高效薄层色谱的吸附剂颗粒细小 (5 μm) , 颗粒粒径分布窄, 一般为3~8 μm, 可用喷雾法喷在薄板上制成[8,9];点样方式有所改进, 和毛细管点样器相比可以自动或半自动完成, 使得在同一块板上点样数增加;展开方式除了同普通薄层色谱一样地直线展开外, 还可采用圆心式展开和向心式展开。随着点样技术、板技术的改进以及检测灵敏度的提高, 高效薄层色谱的分离能力大大提高。高效薄层色谱与普通薄层色谱薄层板的比较见表1。
 
现代高效薄层色谱结合其他联用检测技术, 其灵敏度和可靠性已接近或达到高效液相色谱[10]效果, 由于使用正相展开剂体系, 成为高效液相色谱一个互补的分析手段[11]。高效薄层色谱有如下突出的优点[9,12]:容量大, 一块高效薄
 
普通薄层色谱TLC 10~15 250 100~150 30~200 50 100~1000
高效薄层色谱HPTLC 5~7 100、200 30~50 3~20 5~10 10~100
 
层色谱能同时对多达40个样品进行分离;效率高, 平均1 min分离5个以上组分;因为使用的是一次性的固定相, 故避免了记忆效应;快速、价廉;鉴定可靠;定量准确;灵敏;广泛地应用于医药、环境、食品化学等方面的定性和定量分析[13,14,15,16,17]。高效薄层色谱被认为是最适合评价中草药原料及其提取物活性成分的一种分析方法。美国草药典 (AHP) 将高效薄层色谱作为其基本的手段用于品种的鉴别, 并根据指标成分的定量分析, 相应地确定药材的相关品质[18]。图1为同一块薄层板上2种紫锥菊 (紫锥菊和狭叶紫锥菊) 根提取液及其不同比例混合物的指纹图谱。从左到右分别为:海胆苷 (Echinacosid) 、咖啡酰酒石酸 (Caftaric acid) 、紫锥菊 (Echinacea purpurea) 、紫锥菊-狭叶紫锥菊 (E.purpurea-E.angustifolia, 75%∶25%) 、紫锥菊-狭叶紫锥菊 (50%∶50%) 、紫锥菊-狭叶紫锥菊 (25%∶75%) 、狭叶紫锥菊、洋蓟酸 (Cynarin) 、菊聚酸 (Cichoric acid) 。全部分析所需时间包括点样、展开、显色和照相只需约20 min[19]。
图1 高效薄层色谱分离紫锥菊属植物根提取物Fig.1 Separation of Echinacea root extracts by HPTLC
 
Kaur等采用高效薄层色谱分析了止泻木 (Holarrhena antidysenterica) 中的康里新 (Conessine) [20]。Evans等采用高效薄层色谱在不同条件下分析了光滑双脐螺 (Biom- phalaria glabrata) 中的β-胡萝卜素和叶黄素的含量[21]。杨成等采用高效薄层色谱法分析多糖酸水解产物, 同时应用2种显色剂以及薄层扫描技术获得可区别中药多糖的特征图谱以及多糖酸水解产物中2类成分的特征薄层色谱, 可用于区分来自冬虫夏草、灵芝、黄芪、人参、西洋参和三七的6种多糖组分[22]。颜玉贞等建立了专属性强、重现性好、荧光色谱灵敏度高的三七药材皂苷类成分的高效薄层色谱指纹图谱, 用以快速考察商品三七质量[23]。Zhou等利用高效薄层色谱分析了球茎草芦中的生物碱[24]。有学者利用高效薄层色谱分析了远志科 (Polygalaceae) 植物中的氧蒽酮[25]。
3 制备薄层色谱法
 
制备薄层色谱通常用于分离提纯1~1 000 mg的物质, 比分析型的薄层色谱处理量要大。分析型的薄层色谱载样量一般小于1 mg样品/g吸附剂, 制备薄层色谱样品过载, 一般大于1 mg/g吸附剂。制备型薄层色谱的尺寸和厚度均比分析型的要大 (通常厚度为0.5~2.0 mm) , 制备薄层色谱不再“薄”, 故又被称为Preparative layer chromatography (PLC) [26]。制备薄层色谱最主要的目标不是要达到最大的峰容量, 而是要得到最大的分离收率, 以得到纯的化合物来进行色谱、光谱分析或进行生物活性检测等, 故其非常适合于微量制备分离的场合。展开剂可以通过毛细作用展开, 也可以通过压力展开[27,28] (或强迫流动展开) 。相对于分析型的薄层色谱, 制备薄层色谱由于板尺寸大, 吸附剂的颗粒大, 而且样品过载, 所以同等条件下制备薄层色谱的分离效果比分析型的薄层色谱的分离效果要差。制备薄层色谱要得到较好的分离效果, 其使用的展开剂用来展开分析薄层色谱板时, 至少保证0.1Rf的分离度[27]。制备薄层色谱板的厚度大于1.5 mm时, 分离效果下降, 最优的厚度为0.5~1.0 mm;展开距离不能超过20 cm[29]。
 
制备薄层色谱与分析型薄层色谱的操作程序基本一样[30]。目前制备薄层色谱法有微量吸管法、融污斑点法、接触加样法、热微量转移技术及滤纸移样法等上样方式[31]。中药研究中纯品的制备一般通过制备薄层色谱法, 因为和制备高效液相色谱比较, 制备薄层色谱成本低、方便、快速, 而且所用试剂对环境的污染也少些。Meyer等利用制备薄层色谱从臭春黄菊 (Anthemis cotula) 中提取出纯的倍半萜内酯-臭春黄菊内酯 (一种致敏原) 标准品[32]。Savikin-Fodulovic等利用制备薄层色谱从散点金丝桃 (Hypericum atomarium ssp.degenii) 中提取出抗菌活性物质异戊二烯化间苯三酚类成分hyperatomarin[33]。Zhu等利用制备薄层色谱纯化制备了1-脱氧野尻霉素 (DNJ) [34]。程德军等通过2次制备薄层色谱纯化得到绿原酸[35]。
4 反相薄层色谱法
 
当流动相的极性大于固定相的极性时, 就形成反相薄层色谱, 一般反相薄层色谱的固定相是化学键合相, 虽然制备稍复杂, 但其斑点扩散小, 广泛用于多种药品的分离, 特别适合于组分复杂的混合物的分离。目前可以比较便宜地得到硅胶的羟基键合了十八烷基的硅胶板。化学键合相硅胶的硅烷化程度也可为分离提供选择性?筛菅沸灾恃≡袷实惫潭ㄏ嗖牧, 实现最佳分离效果。反相薄层色谱主要用于极性成分复杂的样品, 又可用来考察摸索高效液相色谱的分离条件。按照分离机理, 反相薄层色谱属分配色谱, 利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数 (或溶解度) 不同而使其分离[36]。
 
兰亦青等建立了用反相薄层色谱同时分析白芍中丹皮酚、苯甲酸和芍药苷3组分的定量方法[37]。Marchand等用反相薄层色谱分析了青蒿 (Artemisia annua) 中的青蒿素 (artemisinin) , 并将其与正相薄层色谱作了比较[38]。Atrrog等用反相薄层色谱从Amphoricarpos neumayeri中分离了愈创木内酯 (guaianolides) [39]。
5 微乳薄层色谱法
 
微乳 (ME) 是由油相、水相、表面活性剂以及助表面活性剂在适当比例下自发形成的一种透明或半透明、低黏度、各相同性且热力学稳定的油水混合体系。一般由表面活性剂和助表面活性剂共同起稳定作用。胶束色谱理论[40]认为, 当流动相中存在胶束及两性表面活性剂, 展开体系具有增溶、降低界面张力作用, 并且因静电、疏水、立体、萃取与反萃取等效应, 使其具有独特的选择性, 适用于分离差别细微的物质。微乳与胶束皆属缔合体, 均为无色透明、低黏度的热力学稳定体系, 但微乳与胶束相比, 具有更大的增溶量, 因而更有利对待测组分进行分离鉴定。至1999年, 微乳液开始应用于薄层色谱。与传统薄层层析相比, 微乳薄层色谱分离效果显著提高, 分离的斑点数增加且斑点圆而集中, 灵敏度较高, 重现性和溶剂稳定性良好。
 
付泽华等以SDS-正丁醇-正庚烷-70%水微乳液作为展开剂, 经聚酰胺薄层层析, 分离金钱草中的黄酮类成分, 分离效果及检测灵敏度高, 且斑点圆整集中[41]。张煜等用微乳薄层色谱法分离鉴定了虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的顺、反异构体[42]。
6 二维薄层色谱
 
1944年首次出现二维薄层色谱[43], 特别适用于常规一维薄层色谱不能分离的多组分复杂的混合物, 发展到目前, 已广泛地应用于生物化学、生物学、天然产物、药物和环境化学的分离分析。将样品点在薄层板的一个角上, 先用第1种展开剂展开, 挥干溶剂后, 将薄层板转90°, 再用第2种展开剂展开, 整个过程见图2。
图2 二维薄层色谱的展开过程Fig.2 Development of 2-D TLC
 
 
注:a为在第1种展开体系开始展开;b为第1次展开后的情形;c为将薄层板旋转90°后, 在第2种展开体系开始展开;d为第2次展开后的情形。 Note:a.Start of the first development; b.After the first development; c.Start of the second development after rotating the thin-layer plate 90°; d.After the second development.
 
二维薄层色谱分离时间短, 分离系统利用率高, 利用2种展开剂选择性的差异能很好地分离复杂混合物, 展开剂的选择余地非常大, 是目前唯一比较成熟的二维分离模式[44]。二维薄层色谱成功的一个关键是2种展开剂的选择, 要求2种展开剂具有互补性, 这样才能将那些在一维薄层色谱不能分离的混合物分开。选择和优化二维薄层色谱展开剂有一个很好的方法体系“Prisma”体系[45]。二维薄层色谱可以采用强迫流动展开, 还可以和其他色谱技术联用, 如气相色谱 (GC) 、超临界流体色谱 (SFC) 、高效液相色谱等。用二维薄层色谱可以很好地提取分离植物中的多酚类物质, 如大黄 (Rheum spp.) [46]、三月花葵 (Lavathera trimestris) [47]等。Ciesla等利用二维薄层色谱建立了不同牛防风 (Heracleum spp.) 的鉴别方法[48]。
7 加压薄层色谱法与离心薄层色谱法
 
展开剂可以通过毛细作用展开, 也可以通过压力展开 (或强迫流动展开) , 包括加压薄层色谱法与离心薄层色谱法2种。
 
加压薄层色谱法依靠加压泵将展开剂直接泵入薄层板中, 并通过泵来调节展开剂的流速。分析方式主要有[28]:①离线点样-分离-离线扫描, 可同时分析多个样品;②离线点样-分离-在线检测, 可以和紫外等检测器联接测定连续洗脱后的展开剂;③在线进样-分离-离线扫描, 与进样器连接, 直接在线进样分离后取出薄层板检测, 每次只能分析一个样品;④在线进样-分离-在线检测, 与高效液相色谱法相似?筛菔匝樾枰≡癫煌治龇椒。
 
Dallenbach-Toelke等分别采用薄层色谱法、高效薄层色谱法、加压薄层色谱法等对药用婆婆纳中的环烯醚萜苷进行分离。结果发现, 加压薄层色谱法的分离效果最好[49]。
 
离心薄层色谱法通过高速旋转产生的离心力加速展开剂的运动, 主要特点有分离量大, 分离速度快, 分离性能好, 操作简单, 成本低等。徐晨等用离心薄层色谱法提取纯大豆磷脂酰胆碱[50]。
8 薄层色谱联用技术
 
在众多的色谱联用技术中, 薄层色谱联用技术出现得比较晚, 但后者特别是高效薄层色谱联用技术由于有自己特殊的优势, 如适应性强, 费效比高, 得到的干扰信息少, 检测后已经分离开的样品很容易回收等优点[51], 得到了越来越广泛的应用。包括薄层色谱或高效薄层色谱与高效液相色谱联用、薄层色谱-质谱联用以及薄层色谱与拉曼光谱联用等。薄层色谱是一种分离效率高、成本低、样品用量少、应用广泛的微量分离手段; 而质谱是一种灵敏度高、选择性好、可进行有效定性分析的现代仪器。因此两者的联用, 实现了优势互补, 为复杂样品的定性提供了一条有效的途径。薄层色谱-质谱联用技术接口技术包括提纯直接引入法、热蒸发法、特殊洗脱技术和毛细管技术等。化合物的红外光谱能提供丰富的结构信息, 是定性的有力手段, 也可以用于定量。目前薄层色谱和红外技术联用主要采用原位法、光声光谱检测法、自动洗脱物转移法和红外显微镜法[52]。
 
Schulte等用高效薄层色谱-拉曼光谱联用分析了几种树花粉中的类胡萝卜素[53]。Berkel等用薄层色谱-质谱联用技术分析了北美黄连中的生物碱[54]。
9 结语
 
薄层色谱技术发展到目前已经很成熟了, 和各种检测技术的联用, 使得薄层色谱成为一种越来越强大的技术手段;在药用植物有效成分的分离提取研究中, 也得到越来越广泛的应用。加深薄层色谱理论和技术研究, 进一步拓宽薄层色谱在天然产物研究中的应用, 能够为我国的中药现代化事业作出更大的贡献。
 
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