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色谱法及其相关技术在中药研究中的运用

 
 
中药是几千年来人民智慧的结晶, 它不仅为中华民族的繁衍和人民的健康作出了不可磨灭的贡献而且也给周边的一些国家的医药事业带来了巨大的发展[1], 中药的质量研究一直是中药研究与应用的难点与重点问题, 中药质量研究的目的是保证中药的有效性和安全性,
 
因而需要搞清中药的药效物质、有毒物质及其作用机制, 并对其进行质量控制。现代高新技术和各种化学统计学方法在中药质量研究和质量控制中起着重要的作用, 而色谱及其联用技术作为现代高效分离分析技术更是该研究的重要技术平台之一。色谱法是综合的鉴别手段, 该方法简便、快速, 也是药物质量控制的最主要的方法之一, 在药物分析中的应用越来越广泛。常用的色谱法有如下几种:高效液相色谱法 (HPLC) 、薄层色谱法 (TLC) 、气相色谱法 (GC) 以及高效毛细管电泳法 (HPCE) 等。本文主要对这几种色谱法进行系统的介绍及其技术在中药研究中的运用进行阐述, 从而对中药的质量控制及安全用药等方面作出指导性意义。
1 薄层色谱法
 
薄层色谱法是较早应用于中药快速分析少量物料的一种非常重要的技术, 薄层色谱的主要优点是: (1) 可在同板同时分析多达18个样品的色谱, 时效高; (2) 所用的是正相展开剂, 其组成变化灵活多样, 可适应多种成分的分离; (3) 离线操作, 既可直观比较图谱, 又可上机扫描得到罗阔图和处理数据; (4) 占机时间短; (5) 最突出的优点是比柱色谱多了色彩参数, 得到的是色彩丰富的色谱图像, 直观性强。薄层色谱法的缺点在于其色谱结果易手铺板质量、点样技术、展开剂配制、层析环境中展开剂的均匀度、环境温度湿度等因素的影响, 有时难于重复;显色又受均匀性、灵敏度、稳定性等影响, 这些因素均会使测定结果偏差较大。最近几年围绕着测定的标准化和自动化, 薄层色谱技术有了全新的发展, 按其原理的不同, 薄层色谱法又分为高效薄层色谱法 (HPTLC) 、假相薄层色谱法、反相薄层色谱法 (RPTLC) 。
 
在实际的薄层层析鉴别中, 有时因中药的成分性质相近而难以分开时, 还可采用高效薄层层析法 (HPTLC) , 该方法是采用更细、更匀的吸附剂, 因而提高了分离效果, 使斑点小而圆, 重现性增强。同时, 点样量还可以减少到0.1μL以下, 使原点直径控制在1mm内, 展开时间缩短, 展距缩小 (3~7cm/10~15min) , 达到微量、快速和高效的目的。用HPTLC不仅可以定性, 还可用于定量分析。对生物体内药物分析, 抗菌素发酵成分分析, 药物制剂分析及植物药中有效成分的分析有独特的优势。崔友、孙秀燕等[2]人采用薄层色谱法, 硅胶薄层板, 正己烷:醋酸丁酯 (98∶2) 为展开剂, 香草醛硫酸试液显色, 结果鉴别出莪术油中有效成分是:牛二酮、呋喃二烯和莪术二酮, 表明采用薄层色谱法操作简便、准确、重现性好;杨建明等[3]人采用薄层色谱法鉴别加味三黄片中主要有效成分的方法及薄层扫描法测定三黄片中小檗碱的含量, 本实验通过对加味三黄片中主要有效成分小檗碱、黄芩苷、大黄素及大黄酚进行了定性鉴别, 并对其中主要成分之一小檗碱, 采用了薄层扫描法对其进行了定量分析, 实验结果满意, 方法亦较为简单, 为该产品的质量控制提供了一种较为可靠的依据;张尊听等[4]以高效薄层色谱扫描法测定野葛根中游离葛根索及总葛根索含量;伍庆[5]用高效薄层色谱法建立了快速测定知母药材中菝葜皂苷元的方法;米莉莉等[6]用高效薄层色谱扫描法对天然虫草与人工虫草菌丝体中核苷类有效成分进行含量测定, 同时建立了不同虫草样品的荧光淬灭薄层色谱指纹图谱;梁小洁等[7]用高效薄层色谱法建立仙方玉容膏中黄芪甲苷含量的测定方法;梁乾德等[8]综合运用高效薄层色谱 (HPTLC) 、高效液相色谱 (HPLC) 、电喷雾离子化质谱 (ESI-MS) 3种方法对四物汤的Cl, C2, C3部位及四味单药相应部位进行分析和比较;Ohon T等[9]采用RPTLC, 对人参、红参中人参皂苷Rg1, 龙胆、日本龙胆中龙胆苦苷, 葛根中葛根素, 栀子中栀子苷, 五味子中五味子素, 生姜中姜辣素进行了鉴定。采RP218F254S薄层板, 展开系统为:人参、红参:硫酸钠 (1y20) 2乙腈2甲醇 (10B7B3) ;龙胆、日本龙胆:水2乙腈 (7B3) ;葛根、栀子:硫酸钠 (1y20) 2乙腈2甲醇 (10B3B3) ;五味子:正己烷222丁酮 (3B1) ;生姜:22丁酮2甲醇2水 (1B1B1) 。点样量:10L, l上行展开约10cm人参、红参喷硫酸后110e加热5min显色, 其余紫外线254nm观察荧光斑点。结果在上述展开系统条件下各药材薄层斑点分离良好, 且重现性好。
2 气相色谱法及气相色谱-质谱联用技术
 
气相色谱以气体为流动相, 具有分离效能高, 灵敏度高, 用量少, 分析速度快等优点, 适合于植物的挥发油成分及其他易挥发性成分或可转化为可挥发的成分测定。对于一些具有挥发性成分的中药的鉴别, GC能发挥独特的作用。中药制剂在原料和工艺条件严格控制一致时, 其成分组成也是比较稳定的, 也可用GC指纹图谱进行鉴别和质量评定。冯毅凡等[10]采用气相色谱法对华佗再造丸及其主要味药进行了指纹图谱分析, 并依据图谱中各成分的含量对华佗再造丸的质量优劣进行了评价。傅梅红等[11]人用GC法测定苍术药材中有效成分β-桉叶醇的含量;肖雪梅[12]用气相色谱法测定风痛灵中丁香酚的含量;苏薇薇等[13]对乌鸡白凤丸的气相色谱指纹特征进行了研究, 认为其可用于鉴别乌鸡白凤丸的真伪;郑少珠[14]采用气相色谱法, 以联苯为内标, 对莪术醇原料药进行了含量测定, 此方法简单, 快速, 灵敏;郭丽冰等[15]人用直接蒸馏-打孔树脂浓缩-气相色谱法, 以正十七烷为内标物, 对徐长卿中的丹皮酚进行含量测定, 结果表明, 在所测浓度范围内, 峰面积与被测物浓度的线性关系良好, 回收率较高。
 
气-质联用技术更增强了其定性功能, 不仅能区分不同中药中挥发性成分的差别, 还可阐明被检成分的结构。GC和GC/MS用于中药指纹图谱研究时, 含挥发性成分中药取样的代表性、合理性对实验结果的稳定性影响尤为显著, 欧阳臻等[16]人用气相色谱一质谱联用技术 (GC-MS) 分析不同产地17个茅苍术样品, 研究茅苍术挥发油的指纹图谱, 计算结果表明不同产地茅苍术与道地的相比差异明显, 为茅苍术的内在质量评价和鉴定提供特征性数据, 为道地茅苍术的质量鉴别和评价及与伪品及混淆品的区别提供了依据;吴玫涵等[17]用气相色谱一质谱法对10种不同产地的小茴香挥发油进行化学成分的分折, 共鉴定出20种化合物, 结果表明不同产地小茴香的总离子流图有较大共同点, 但亦存在不同之处, 各组分的相对百分含量不尽相同, 此项研究为今后小茴香药材及其有关制剂的质量控制奠定了基础, 为今后小茴香药材建立定性指纹图谱提供了依据, 为挥发油类成分的分析和研究提供了可行的方法;廖远熹等[18]人运用静态顶空-毛细管气相色谱法对6种不同产地柴胡的挥发性成分进行检测, 并运用检索和保留指数相结合的手段对检出的挥发性成分进行定性, 6种柴胡中定性相对含量大于0.2%的挥发性成分60种, 其中挥发性成分中脂肪醛类物质的含量最大, 占总挥发性物质的25%~44%;郭方遒等[19]人采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法 (HS-SPME-GC-MS) 对白术中的挥发性成分进行了分离鉴定了, 并与采用传统的水蒸气蒸馏法 (SD-GC-MS) 提取的挥发性成分进行了比较, 结果采用HS-SPME-GC-MS鉴定出了41组分, 采用SD-GC-MS鉴定出了31种组分, 表明HS-SPME-GC-MS方法作为一种简单快速便利的手段非常适合用于白术中挥发性物质的提取和分析;周长新等[20]人运用GC-MS测定当归挥发油中藁本内酯的含量, 建立GC-MS选择离子检测外标定量方法, 此方法灵敏、快速、准确, 可供当归挥发油质量控制及藁本内酯的含量测定;王发松等[21]人采用GC-MS技术分析荆条叶挥发油中的化学组成, 结果从荆条叶中共分离出了36种组分, 确定了29种成分的化学结构和相对含量;GC-MS的二维数据可用于定性和定量测定五味子药材中的挥发性成分;还有人采用内标法测定莱菔子、北葶苈子等中药中的总异氰酸酯含量;刘敬兰[22]采用衍生化毛细管气相色谱法分离测定山梨醇和甘露醇, 用苯基氰丙基聚硅氧烷 (BPX-X) 毛细管色谱柱程序升温法对山梨醇和甘露醇的乙酰酯进行了很好的分离, 并用内标法进行定量分析。
3 毛细管电泳法
 
近两年, CE以极快的速度发展, 目前已深入到化学研究所涉猎的几乎所有领域毛细管电泳由于定量分析的重现性等问题, 在中药成分的含量测定方面有一定的局限性, 但其极高的分离效能, 使其很适合于中药指纹图谱的测定。林炳承[23]对CE的近期理论及应用研究作了总结, 并且对CE在中国的发展作了综合评述。刘志松等[24]综述了CE在药物分析中的应用。此外, CE对单细胞的分析, CE对手性物质的分离, CE对DNA多态性电负性, CE在临床诊断上的应用也有专门论述。在分离模式方面, 对毛细管电色谱、毛细管离子电泳、亲和毛细管电泳、毛细管等电聚焦及非水毛细管电泳分别有综述!渡住方沧改拷侥甑闹饕谌荽蠖嘤隒E有关, 在此栏目中王义明等对CE的原理和应用进行了系列讲座, 内容括:CE柱技术、CE在氨基酸、肽及蛋白质分析中的应用及其在医药领域的应用。对CE的应用研究主要集中在蛋白质分离、体液分析、药物分析、天然植物的分离分析以及对手性大分子、多价态无机小离子的分离方面。王青虎等[25]人采用高效毛细管电泳法测定小白蒿中5种黄酮类化合物的含量, 并对不同采集时间小白蒿和不同部位中5种黄酮类化合物的含量进行比较, 结果表明小白蒿的花中的黄酮类化合物的量高于叶和茎;并综合分析得出小白蒿的采集时间应为6月中旬到7月末。孙新建等[26]人采用高效毛细管电泳法测定地稔中没食子酸的含量, 建立测定地稔中的有效成分没食子酸含量的高效毛细管电泳法。方法:采用内标法, 选取苯甲酸钠为内标, 未涂层熔融石英毛细管柱 (57cm X7μm, 有效长度50cm) 为分离通道, 以12mmol/L硼砂-甲醇 (85∶15) 为电泳介质, 分离电压25KV, 检测波长215nm, 结果在上述条件下, 没食子酸在15min内得到很好的分离, 在2.37~47.40μg/m L范围内线性关系良好, 平均加样回收率为98.5% (r=0.9998) 。从而表明该方法简便快速、结果准确、重现性好, 可用于地稔及其制剂的质量控制。郑畅等[27]人采用非共价涂层毛细管电泳法测定黄连及其炮制品中3种生物碱的含量, 他们应用聚凝胺-聚丙乙烯磺酸钠涂层毛细管柱 (33cm X50μm ID., 有效长度为24.7cm) , 运行缓冲液为500mmol/L Tris-甲醇 (体积比为70∶30) 缓冲溶液 (8mol/L, 磷酸调节p H7.5) , 分离电压为22KV, 检测波长为230nm, 温度为20℃, 压力自动进样 (5000Pa X6s) , 阴极检测。结果在所选电泳条件下, 黄连中的生物碱组分在4.5min内得到良好分离, 盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸药根碱的线性关系良好, 加样回收率较高, 表明该方法可用于黄连药材中生物碱的分析测定。
4 高效液相色谱法
 
由于大部分中药材中的活性成分为高沸点、热不稳定性物质, 如生物碱类、皂苷类、黄酮类等, 甚至为生物大分子, 如多肽、多糖等, 因此HPLC法已广泛地应用于中药指纹图谱的建立, 这些指纹图谱与定量分析指标相结合可用于中药材的鉴别、中药质量的控制及中药质量的评价等。通过HPLC指纹图谱的获取、验证和鉴别三个步骤, 得出供鉴别用的对照指纹图谱, 进而确定指标成分峰、特征峰的相对保留时间及范围, 可用于中药材和饮片的鉴别。采用HPLC法对中药进行定性鉴别、定量鉴别, 并对其进行指纹图谱分析, 这对中药的质量控制及安全用药等方面具有重大的实际意义。
4.1 定性鉴别
 
中药的品种、真伪鉴别是中药质量控制的首要任务之一。高效液相色谱HPLC法由于具有分离效能高、分析速度快、适用范围广、流动相选择范围宽、灵敏度高、色谱柱可多次利用、流出组分可收集、重现性好等优点, 目前已广为普及用于中药分析中。刘艳等[28]人采用HPLC法测定并比较不同产地楤木中楤木皂苷A的含量, 表明该方法可用于楤木的质量控制。杨蕾等[29]人运用高效液相色谱 (HPLC) 梯度洗脱同时测定了长春花中的文多灵、长春质碱和脱水长春碱等3种生物碱。其中色谱柱为Water5C18-MS (250mm×4.6mm) , 流动相为甲醇-1%二乙胺 (磷酸调PH至7.3) 系统, 梯度洗脱, 检测波长为220nm, 柱温为25℃, 结果表明用该法同时检测了不同干旱条件处理下长春花样品中的文多灵、长春质碱和脱水长春碱, 方法准确、快速、简便。邢俊波等[30]采用HPLC-UV-MS方法鉴别中药制剂中可能添加的糖皮质激素, 方法采用高效液相色谱、质谱法。SUPELCO Discovery C18 (250mm×4.6mm, 5μm) 分析柱;乙腈-水为流动相进行梯度洗脱;检测波长为243nm;流速1.0 m L/min;电喷雾离子源, 采用质谱多重反应监测 (MRM) 扫描方式, 结果在该液相条件下, 能同时有效分离6种糖皮质激素。应用该法鉴定了中药制剂中的糖皮质激素, 通过液相色谱保留时间、相对分子质量、二级质谱碎片信息等方面信息, 可确定样品中含有氢化可的松、醋酸泼尼松龙。从而表明本测定方法简便、灵敏, 专属性强, 可为中药制剂中糖皮质激素的检测提供快捷有效的分析方法。杨胜丹等[31]人采用半制备高效液相色谱法分离纯化川木通中齐墩果酸, 纯化齐墩果酸的制备色谱条件:半制备型色谱柱ZOR-BAX SB-C18 (9.4mm×150mm, 5μm) , 流动相乙腈-水=87∶13, 流速3 m L/min, 柱温室温, 检测器VWD检测器, 波长210nm, 进样量20μL。对制备出的馏分进行定性分析, 该法纯化效果好、操作高效、快速。
4.2 定量鉴别
 
常规的中药含量测定是对已知的有效成分或指标性成分进行测定, 测定的成分个数不多, 常常是一到两个成分。随着中药质量标准要求的提高和质量控制技术的发展, 所测定的成分也逐渐增多, 尤其是中药复方, 往往要求测定多个成分。韩超[32]采用高效液相色谱法测定白花前胡提取物中白花前胡甲素的含量, 该方法适用于白花前胡提取物的质量控制。周武庆等[33]人采用反相高效液相色谱法测定酸枣仁颗粒中酸枣仁皂苷A与酸枣仁皂苷B的含量, 采用Hypersil C18柱为分析柱, 使用以乙腈和水为流动相的二元梯度洗脱方法, 检测波长为201nm, 流速为1m L/min。结果酸枣仁皂苷A在50.01~198.2μg/m L与峰面积呈良好的线性关系 (r=0.9998, n=5) , 平均回收率为99.41%;酸枣仁皂苷B在66.25~209.0μg/m L与峰面积呈良好的线性关系 (r=0.9998, n=5) , 平均回收率为99.34%。结论该法简便、快速、重现性好, 适用于酸枣仁颗粒中酸枣仁皂苷A与酸枣仁皂苷B的定量分析。赵文昌等[34]建立测定苦豆子总碱中槐定碱含量的反相高效液相色谱法。该方法采用Kromasil 100-5NH2色谱柱 (250mm×4.6mm, 5μm) , 流动相为乙腈-磷酸水溶液 (p H为2) -无水乙醇 (80∶8∶10) , 检测波长205 nm, 流速1.0m L/min, 柱温30℃。结果槐定碱进样量与峰面积的线性范围为0.02~8.3μg (r=1.000) ;平均加样回收率为98.85%, RSD为3.13% (n=5) ;苦豆子总碱中槐定碱的平均含量为42.7%。结论所采用的反相高效液相色谱法的含量测定方法灵敏度高, 专属性强, 可用于苦豆子总碱中槐定碱的质量控制。俞丽等[35]人运用反相高效液相色谱法同时测定不同产地龙胆中龙胆苦苷 (GPS) 和2'- (2, 3-二羟基苯甲酰) -獐牙菜苷 (DHBS) 的含量, 结果该方法准确、简便、重现性好龙胆的种间 (四基源药材) 的龙胆苦苷和2'- (2, 3-二羟基苯甲酰) -獐牙菜苷 (DHBS) 的含量有较大的差异。何昱等[36]人针对不同批次丹参采用高效液相色谱及紫外-可见光二极管阵列检测器联用技术 (HPLC-DAD) , 以乙腈-水 (含0.026%磷酸) 为流动相进行梯度洗脱, 检测波长270nm, 柱温24℃。结果10个批次丹参提取液中, 原儿茶醛、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮IIA浓度在2一定范围内呈良好的线性关系, 而其中原儿茶醛的含量为0.00124%~0.00205%, 丹酚酸B的含量为7.26%~9.94%, 隐丹参酮的含量为0.190%~0.568%, 丹参酮IIA含量为0.512~1.252%。表明应用HPLC-DAD法同时对丹参中原儿茶醛、丹酚酸B、隐丹参酮及丹参酮IIA的测定结果准确可靠, 可同时将它们作为丹参的质量控制指标。
4.3 HPLC指纹图谱分析
 
对中药材或中成药的某个有效成分或指标成分进行定性定量分析仍不能有效地控制中药材或中成药的质量指纹图谱作为一种新的分析方法正适用于这种要求和中药的这些特点近年来指纹图谱的运用在国内已经引起了医药工作者极大关注已成为中药现代化领域的一种新趋势文献, 对指纹图谱的定义是经光谱或色谱测定得到的组分群体的特征图谱或图像中药指纹图谱是指某种或某产地中药材经适当处理后采用一定的分析手段得到的能够标示该中药材或中成药特性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱它具有特征性和稳定性通过指纹图谱的特征性能有效鉴别样品的真伪或产地通过其主要特征峰的面积或比例的限定能有效控制样品的质量确保药品质量的相对稳定对非单一成分药物的质量控制而言指纹图谱能全面综合地反应和控制中药或天然药物质量虽然它不能代替含量测定但比测定任何单一成分所提供的信息却丰富和有用得。李丽等[37]人所采用的色谱条件能将防风中各成分有效分离, 全程分析时间70min, 同时进行了10批防风饮片的HPLC指纹图谱的鉴别。经与对照品图谱比较, 在防风饮片HPLC图谱中共检定出l1个化合物, 为防风饮片鉴别提供了新的方法。王巧等[38]用HPLC指纹图谱对白芍与赤芍进行了分析。根据白芍样品的指纹图谱, 发现所有类别的白芍样品的指纹图谱具有基本相同的色谱峰数目, 但各峰之间的面积比值差别较大。而从赤芍和川赤芍 (Paeonia veitchii) 根的指纹图谱可知, 两者的化学成分具有较明显的不同;另外, 白芍和赤芍的化学成分区别明显, 芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷亚硫酸酯、苯甲酸和丹皮酚是两者的最大差别, 芍药苷亚硫酸酯和丹皮酚分别是白芍和赤芍的独有成分。万建波等[39]人建立中药三七的高效液相色谱特征谱, 方法运用加压溶剂提取HPLC-DAD分析28个产地的三七药材, 所得的图谱采用中国药典委员会开发的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (Version2004A) ”软件进行分析, 结果28个三七样品色谱图中各色谱峰分离良好, 从中确定了13个特征峰, 其中8个主要色谱峰经对照品确认, 所有药材色谱图与软件生成的对照谱相似度为高, 因此此该方法简便、重现性好、具可操作性, 可科学评价及有效控制三七药材质量。章弘扬等建立了清开灵注射液HPLC-UV-MS/MS指纹图谱, 为中药复杂体系的分析及其质量控制提供了一种有效、可靠的模式。
5 结语
 
综上所述, 中药质量的研究正在朝着全面、综合的方向发展, 色谱技术以其高效的分离优势和多种检测方法在中药质量研究中发挥着越来越重要的作用, 而其中HPLC及其联用技术在中药的研究中起着至关重要的作用。中药定性定量技术的发展是中药现代化的核心内容, 也是中药国际化的关鍵。我们应该有组织地开展多学科合作, 应用新技术深入研究中药的理化性质和含量测定, 建立提出和推广自己的中药国际标准, 最终达到影响世界, 实现双向接轨的目标。
 
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